发光免疫分析技术.ppt
化学发光免疫分析技术,化学发光免疫分析技术,慨 述-化学发光-化学发光效率化学发光剂和标记技术-化学发光剂-发光剂的标记技术化学发光免疫分析的类型-直接化学发光免疫分析-化学发光酶免疫分析-电化学发光免疫分析,什么是发光免疫分析？是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。,放射免疫技术,酶免疫技术,发光免疫技术,三大经典标记技术,发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再 返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。,发光的基础知识,光照发光（photoluminescence）指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发 态，其回至基态时，发射出较长波长的光。生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的 发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光 素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧 化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形 式释放出来。化学发光,发光的基本类型,化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。化学发光又分为：直接化学发光间接化学发光,什么是化学发光,一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程简单地描述如下：A十B C*C*C h为光子，C*表示C处于激发态,直接化学发光,若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程表示如下：A十B C*C*十D C十D*D*D十h,间接化学发光,化学发光剂和标记技术,在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。,一、化学发光剂,发光的量子产率高；它的物理-化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性,化学发光剂的基本条件,直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。,（一）直接化学发光剂,一.代表物质：吖啶酯，在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。,二.另一类代表物质：三联吡啶钌，RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。,三联吡啶钌,电化学发光剂反应原理,利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂。代表物质：鲁米诺及其衍生物，AMPPD,（二）酶促化学发光剂,鲁米诺增强发光反应原理,AMPPD3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷,化学发光免疫分析的类型,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,一、直接化学发光免疫分析,发光,Y,Y,Y,磁微粒子,被测抗原,+,抗体,+,丫啶酯标记物抗体,冲洗后,（1）加入H2O2（pH10）,（2）加入碱（pH10）,直接化学发光分析-夹心法,电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。,二、电化学发光免疫分析,磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反应体系内待测标本与相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光强度与待测抗原浓度成正比。,电化学发光免疫分析,电化学发光免疫分析示意图,以TSH为例：第一步：结合了活化的三联吡啶钌衍生物即Ru(bpy)32+N羟基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中，孵育9分钟。第二步：将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。下一步，蠕动泵将形成的Ru(bpy)32+抗体抗原抗体磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与Ru(bpy)32+结合的抗体）也被吸出测量室。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。发光剂Ru(bpy)32+和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+q，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPAq，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的Ru(bpy)33+，使其形成激发态的Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的Ru(bpy)32+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的Ru(bpy)32+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与Ru(bpy)32+的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。最后，终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。,化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，处理信号计算出测定物的浓度。,三、化学发光酶免疫分析,该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。,（一）HRP标记化学发光免疫分析,HRP标记化学发光免疫分析,该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。,（二）AKP标记化学发光免疫分析,AKP标记化学发光免疫分析,加样品、磁颗粒子、试剂,孵育，使反应物结合,清洗去除未结合物质,加入底物 产生信号,孵育，促使信号的产生,信号检测,分析步骤-一步法,小 结,发光指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃 迁到激发态，然后再回到基态，并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能 使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结 合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技 术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫 分析和电化学发光免疫分析。,
