化学成分研究方法.ppt

1,中药有效成分的分离与精制,本节介绍中药化学成分的一般分离方法，有萃取、沉淀、结晶、色谱等方法。重点掌握中草药有效成分分离方法的原理及规律。物质分离的许多操作往往在溶液中进行。实践中可以采用下列方法：,2,（一）根据物质溶解度差别进行分离,1.结晶及重结晶法 利用不同温度可引起物质溶解度改变的性质来分离物质。关于结晶和重结晶概念：结晶是指由非结晶状态到形成结晶的操作过程。重结晶指由纯度低结晶处理成纯度高结晶的操作过程。二者从操作角度差别是起始物不同。,3,（一）根据物质溶解度差别进行分离,判断结晶纯度的方法。（1）晶型均一，色泽均匀。（2）有一定的熔点和较小的熔距，熔距应在2度以内。（3）TLC或PC分别用三种以上溶剂系统检识，同单一圆整斑点。（4）HPLC或GC检查呈现单峰。,4,（一）根据物质溶解度差别进行分离,结晶和重结晶操作：提取或分离物 溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤 溶液 放置（冷藏）析晶，过滤 粗结晶 重复上述操作（重结晶）结晶,5,（一）根据物质溶解度差别进行分离,选择结晶溶剂的原则是：对要结晶的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，对杂质冷热都不溶或冷热都易溶；另外要求结晶溶剂不与待结晶物质发生化学反应；沸点较低、易挥发；无毒或毒性很小。选择溶剂依据“相似相溶”原理。,6,（一）根据物质溶解度差别进行分离,2.沉淀法（溶剂沉淀法）在溶液中加入另一种溶剂以改变混合的极性，使一部分物质沉淀析出。从而实现分离。如：水提醇沉法（除去多糖或蛋白质）；醇提水沉法（除去树脂或叶绿素）；醇提乙醚沉淀或丙酮沉淀法（使皂苷沉淀析出）,7,（一）根据物质溶解度差别进行分离,水提醇沉法系指处方中药材加水煎煮，既提取出有效成分，如：生物碱盐、甙类、有机酸类、氨基酸、多糖类等；同时也提出一些水溶性杂质，如：淀粉、蛋白质、粘液质、鞣质、色素、无机盐等。若往水煎液中加入适量乙醇，可以改变其溶解性能而将杂质部分或全部除去。当乙醇浓度达到60%70%时，除鞣质、树脂等外，其他杂质已基本上沉淀而除去。如果分23次加入乙醇，浓度又逐步提高，最终达到75%80%，则除去杂质的效果更好。,8,（一）根据物质溶解度差别进行分离,醇提水沉法系指将中药原料用一定浓度的乙醇用渗漉法、回流法提取，即可提取出生物碱及其盐、甙类、挥发油及有机酸类等；虽然多糖类、蛋白质、淀粉等无效成分不易溶出，但树脂、油脂、色素等杂质却仍可提出。为此，醇提取液经回收乙醇后，再加水处理，并冷藏一定时间，可使杂质沉淀而除去。40%50%的乙醇可提取强心甙、鞣质、蒽醌及其甙、苦味质等；60%70%乙醇可提取甙类；更高浓度乙醇则可用于生物碱、挥发油、树脂和叶绿素的提取。,9,（一）根据物质溶解度差别进行分离,3.pH法：对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸、碱以调节溶液的pH值，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。酸提碱沉法（使生物碱类成分沉淀）。碱提酸沉法（使黄酮、蒽醌等沉淀）；等电点法（使蛋白质沉淀）,10,（一）根据物质溶解度差别进行分离,4.金属盐沉淀法：酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出。,11,（一）根据物质溶解度差别进行分离,铅盐沉淀法：利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或络盐沉淀而分离的方法。中性醋酸铅可沉淀具有邻二酚羟基和羧基的成分；碱式醋酸铅的沉淀范围较广，可沉淀含酚羟基和羧基及中性皂苷等。如沉淀为杂质，则可弃去；如沉淀为所要成分，则可将沉淀悬浮于水或稀醇中，通H2S气体或加入稀H2SO4、Na2SO4等脱铅，成分即可分离。,12,（一）根据物质溶解度差别进行分离,专属试剂沉淀法:某些试剂能选择性地沉淀某类成分，称为专属试剂沉淀法。如雷氏铵盐能与水溶性生物碱类生成沉淀，可用于分离水溶性生物碱与其它生物碱；胆甾醇能和甾体皂苷沉淀，可使其与三萜皂苷分离；明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质等。,13,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,常见的方法有:简单的液液萃取法、逆流分溶法(CCD)、液滴逆流色谱法(DCCC)、高速逆流色谱(HSCCC).,14,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,1液一液萃取与分配系数K值 将两种相互不能任意混溶的溶剂(例如氯仿与水)置分液漏斗中充分振摇，放置后即可分成两相。此时如果其中含有溶质，则溶质在两相溶剂中的分配比(K)在一定的温度及压力下为一常数，可以用下式表示：,15,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,K：表示分配系数；CU：表示溶质在上相溶剂中的浓度；C L：表示溶质在下相溶剂中的浓度。现在假定有A、B两种溶质用氯仿及水进行分配，如A、B的重量均为1.0g，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比VCHCl3VH20=1，则用分液漏斗作一次振摇分配平衡后，约90的溶质A将分配在上相溶剂(水)中，约10的溶质A则分配到下相溶剂(氯仿)中。同理，KB=0.1=11 0，在振摇平衡后，则溶质B的分配将与A相反。留在水中的约为10，约90分配在氯仿中。这说明，在上述条件下，A、B两种溶质在氯仿及水中仅作一次分配就可实现90的分离。,16,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,2分离难易与分离因子 现在，我们可以用分离因子值来表示分离的难易。分离因子可定义为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。即：上例中，=KAKB=100.1=100。,17,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,就一般情况而言，100，仅作一次简单萃取就可实现基本分离；但10010，则需萃取1012次；2时，要想实现基本分离，须作100次以上萃取才能完成；1 时，则KA KB，意味着两者性质极其相近，即使作任意次分配也无法实现分离。而实际分离工作中，我们总是希望选择分离因子值大的溶剂系统，以求简化分离过程，提高分离效率。,18,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,3分配比与pH 对酸性、碱性及两性有机化合物来说，分配比还受溶剂系统pH的影响。因为pH变化可以改变它们的存在状态(游离型或离解型)，从而影响在溶剂系统中的分配比。以酸性物质(HA)为例，其在水中的离解平衡及离解常数K可用下式表示：,19,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,两边取负对数则：,20,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,Ka及pKa均可用来表示酸性物质的酸性强弱。酸性越强，Ka越大，pKa值越小。若使该酸性物质完全离解，即使HA均转变成A一则：,故：,21,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,因为酚类化合物的pKa值一般为92108，羧酸类化合物的pKa值约为5，故pH3 以下大部分酚酸性物质将以非离解形式(HA)存在，易分配于有机溶剂中；而pH12以上时，则将以离解形式(A一)存在，易分配于水中。,22,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,我们也可以由文献上给出的pKa值求出各碱性物质呈游离型或离解型时的pH条件。一般pH12，则酸性物质呈离解状态(A-)、碱性物质则呈非离解状态(B)存在。据此，可采用下图所示在不同pH的缓冲溶液与有机溶剂中进行分配的方法，使酸性、碱性、中性及两性物质得以分离。,23,缓冲液：当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化的作用，称为缓冲作用，这样的溶液叫做缓冲溶液。弱酸及其盐的混合溶液（如HAc与NaAc），弱碱及其盐的混合溶液（如NH3H2O与NH4Cl）等都是缓冲溶液。缓冲溶液作用原理和pH值由弱酸HA及其盐NaA所组成的缓冲溶液对酸的缓冲作用，是由于溶液中存在足够量的碱A-的缘故。当向这种溶液中加入一定量的强酸时，H 离子基本上被A-离子消耗：缓冲溶液的pH值几乎不变；当加入一定量强碱时，溶液中存在的弱酸HA消耗OH-离子而阻碍pH的变化。,24,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,利用pH梯度萃取分离物质的模式图,25,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,4逆流分溶法(CCD)液一液萃取分离中经常遇到的情况是分离因子值较小，故萃取及转移操作常须进行几十次乃至几百次。此时简单萃取已不能满足需要，而要采用逆流分溶法(counter current distribution，简称CCD)。,26,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,CCD法的分离过程示意图,27,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,Craig逆流分溶仪萃取单元,28,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,逆流分溶仪萃取单元的工作过程,29,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,CCD法因为操作条件温和、试样容易回收，故特别适于中等极性、不稳定物质的分离。另外，溶质浓度越低，分离效果越好。但是，试样极性过大或过小，或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易采用此法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不宜采用。,30,乳化的概念：乳化是液-液界面现象，两种不相溶的液体，如油与水，在容器中分成两层，密度小的油在上层，密度大的水在下层。若加入适当的表面活性剂在强烈的搅拌下，油被分散在水中，形成乳状液，该过程叫乳化。（如果发生乳化，难以分离）,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,31,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,5液一液萃取与纸色谱 分离因子是液液萃取时判断物质分离难易的重要参数。一般50时，简单萃取即可解决问题，但50时，则宜采用逆流分溶法。问题是对于未知成分组成的混合物来说，不知道混合物中各个组分在同一溶剂系统中的分配比又如何求得值呢?这里可以借助纸色谱(PC)的帮助。已知PC的原理与液-液萃取法基本相同，Rf值与分配系数K之间有下列关系：,32,33,r为纸层色谱定数。当色谱滤纸湿重(W湿)为干重(W干)的15倍时，r=2。设A、B两种(或两组)物质的Rf值分别为Rfa及Rfb，则 其中RfaRfb 据此，可用PC选择设计液液萃取分离物质的最佳方案,34,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,6液一液分配柱色谱 逆流分溶法分离物质在分液漏斗中或Craig逆流分溶仪中进行时，前者手工操作，比较费时；后者因仪器自身的问题，在振摇时容易引起破损及漏液，又因溶剂消耗量大，振摇过程中又易于乳化，故现在已很少应用，多改用其它装置。如将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂(流动相)冲洗色谱柱。这样，物质同样可在两相溶剂中相对作逆流移动，在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。这种方法称之为液液分配柱色谱法。,35,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,(1)正相色谱与反相色谱：液一液分配柱色谱用的载体主要有硅胶、硅藻土及纤维素粉等。通常，分离水溶性或极性较大的成分如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时，固定相多采用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动相则用氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂，称之为正相色谱；但当分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等时，则两相可以颠倒，固定相可用石蜡油，而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂，故称之为反相分配色谱(reverse phase partition chromatography)。,36,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,除色谱柱外，液一液分配色谱也可在色谱用硅胶薄层色谱上进行。因此液液分配柱色谱的最佳分离条件可以根据相应的薄层色谱结果(正相柱用正相板，反相柱用反相板)进行选定。,37,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,常用反相硅胶薄层色谱及柱色谱的填料系将普通硅胶经下列方式进行化学修饰，键合上长度不同的烃基(R)形成亲脂性表面而成。,38,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,根据烃基(-R)长度为乙基(-C2H5)还是辛基(-C8H17)或十八烷基(-C18 H37)，分别命名为RP(reverse phase)-2、RP-8及RP-18。三者亲脂性强弱顺序如下：RP-18RP-8RP-2。,39,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,(2)加压液相柱色谱：经典的液一液分配柱色谱中用的载体(如硅胶)颗粒直径较大(1OO150 m)，流动相仅靠重力作用自上而下缓缓流过色谱柱，流出液用人工分段收集后再进行分析，因此柱效较低，费时较长，近来已逐渐被各种加压液相色谱所代替。加压液相色谱用的载体多为颗粒直径较小、机械强度及比表面积均大的球形硅胶微粒，如Zipax类薄壳型或表面多孔型硅球以及Zorbax类全多孔硅胶微球，其上并键合不同极性的有机化合物以适应不同类型分离工作的需要，因而柱效大大提高。常见的Zorbax系列HPLC填充柱型号见表11。,40,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,表1-1 HPLC用Zorbax系列填充柱,41,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,为了提高分离速度、缩短分离时间，则须施加压力，且依所用压力大小不同，可以分为快速色谱(flash chromatography，约2.02105 Pa)、低压液相色谱(LPLC，20.2l05 Pa)等。各种加压液相色谱的分离规模如下图所示,42,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,各种加压液相柱色谱的大体分离规模,43,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,此外，在色谱柱出口处常常配以高灵敏度的检测器，以及自动描记、分部收集的装置，并用计算机进行色谱条件的设定及数据处理。故无论在分离效能及分离速度方面，加压液相色谱均远远超过了经典的液液分配柱色谱方法，在天然药物分离工作中得到了越来越广泛的应用。下图为常用高压液相装置的模式图。,44,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,高压液相色谱装置的模式图A 溶剂贮槽B 高压液送泵C 防止脉冲装置D 色谱柱E 进样阀 F 检出装置G记录装置H.计算机,45,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,近来，中低压液相柱色谱装置及EMerck公司生产的配套用Lobar柱因分离规模较大(可达克数量级)、分离效果较好(有时不亚于HPLC所得结果)、分离速度较快(填充剂颗粒较大，约4060 m)、分离条件又可由相应的TLC结果直接选用，加之价格比较便宜、操作简便，故很受用户欢迎。常用Lobar柱的型号及规格可参见下表进行选择。,46,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,常用Lobar柱的型号及可能分离规模,47,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,Lobar柱可选用耐压送液泵(最大不超过6.06105Pa)或与HPLC的送液泵联用。无条件时也可采用高位溶剂贮液槽造成的位能差进行。在分离大量试样时，并可将几根柱子串联使用，以提高分离效果，并且用过的柱子可反复再生多次重复使用，值得推广普及。,48,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,7液滴逆流色谱(DCCC)及高速逆流色谱(HSC-CC)1970年，由Tanimura在液-液分配色谱基础上创建的液滴逆流色谱装置(Droplet counter current chromatography，简称DCCC)可使流动相呈液滴形式垂直上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的逆流色谱分离(左图)。,49,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,液滴逆流色谱DCCC装置示意图 HSCCC分离物质原理模拟图,50,*溶剂分配法中溶剂系统的选择：两相溶剂不相混溶，混合物中各单一成分在溶剂系统中的分配系数差别越大越好。分离酸碱两性化合物时，缓冲液是很好的溶剂。*操作注意：（1）先将两相溶剂相互充分饱和。（2）采用等体积两相溶剂的方式。（3）欲分离混合物的浓度不宜过高。,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,51,（二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,DCCC以及HSCCC均可克服上述液相色谱中因为采用固体载体所引起的不可逆吸附消耗、试样变性污染及色谱峰畸形拖尾等弊病，试样还可以定量回收，目前已广泛用于皂苷、生物碱、酸性化合物、蛋白质、糖类等天然化合物的分离精制工作，并取得了良好的效果。,52,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,在中药有效成分分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其中又以固液吸附用得最多，并有物理吸附、化学吸附及半化学吸附之分。,53,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,物理吸附(physical adsorption)也叫表面吸附，是因构成溶液的分子(含溶质及溶剂)与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用所引起。特点是无选择性、吸附与解吸过程可逆、可快速进行，故在实际工作中用得最广。如采用硅胶、氧化铝及活性炭为吸附剂进行的吸附色谱即属于这一类型；,54,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,化学吸附(chemical adsorption)，如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附，或生物碱被酸性硅胶吸附等，因为具有选择性、吸附十分牢固、有时甚至不可逆，故用得较少；半化学吸附(semi-chemical adsorption)，如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附，力量较弱，介于物理吸附与化学吸附之间，也有一定应用。,55,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,1物理吸附基本规律相似者易于吸附 固液吸附时，吸附剂、溶质、溶剂三者统称为吸附过程中的三要素。以静态吸附来说，当在某中药提取液中加入吸附剂时，在吸附剂表面即发生溶质分子与溶剂分子、以及溶质分子相互间对吸附剂表面的争夺。物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱及先后顺序都大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。,56,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,硅胶、氧化铝因均为极性吸附剂，故有以下特点：(1)对极性物质具有较强的亲和能力，极性强的溶质将被优先吸附。(2)溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。(3)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加人极性较强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。,57,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,活性炭因为是非极性吸附剂，故与硅胶、氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。故从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。,58,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,2极性及其强弱判断 极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。极性是一种抽象概念，用以表示分子中电荷不对称(assymmetry)的程度，并大体上与偶极矩(dipo1emoment)、极化度(polarizability)及介电常数(dielectrie constant)等概念相对应。,59,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(1)官能团的极性强弱按下表顺序排列：,官能团的极性,60,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(2)化合物的极性则由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素所决定。以氨基酸来说，分子结构中既有正电基团，又有负电基团，故极性很强。高级脂肪酸，如硬脂酸，虽也含有如羧基这样的强极性基团，但因分子的主体乃由长链烃基所组成，故极性依然很弱。又如葡萄糖，因分子中含有许多一OH基，故为极性化合物，但鼠李糖(6-去氧糖)及加拿大麻糖(2,6-二去氧糖)因分子中-CH2 OH及-CHOH分别脱去氧变为-CH3及-CH2-，故极性即随之降低。,61,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,次苷D(COOH)C(CH2 OH)A(CHO)B(CH3),苷A苷B次苷D次苷C次苷A次苷B单乙酰次苷B,62,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,极性强弱顺序决定着化合物在硅胶上的吸附行为及柱色谱的洗脱规律 酸性、碱性及两性有机化合物的极性强弱及吸附行为主要由其存在状态(游离型或离解型)所决定，并受溶剂pH的影响。以生物碱而言，游离型为非极性化合物，易为活性炭所吸附；但离解型则不然，为极性化合物，不易为活性炭所吸附。因此实践中常可通过改变溶剂pH以改变酸性、碱性及两性化合物的存在状态，进而影响其吸附或色谱行为达到分离精制的目的。,63,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(3)大体上溶剂极性的大小可以根据介电常数()的大小来判断。常用溶剂的介电常数及其极性排列如表1-5所示：,64,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,65,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,3简单吸附法进行物质的浓缩与精制 简单吸附，如在结晶及重结晶过程中加入活性炭进行的脱色、脱臭等操作，在物质精制过程中应用很广。但要注意，有时拟除去的色素不一定是亲脂性的，故活性炭脱色不一定总能收到良好的效果。一般须根据预试结果先判断色素的类型，再决定选用什么吸附剂处理为宜。此外，从大量稀水溶液中浓缩微量物质时，有时也采用简单吸附方法。例如，报道有人曾采用活性炭吸附法成功地从一叶蔌水浸液中提取一叶蔌碱。方法为将水浸液pH调至碱性(pH8.5)，分次加入活性炭，搅拌，静置，直到上清液检查无生物碱反应时为止。滤集吸碱炭末，干燥后与苯回流，回收苯液即得一叶蔌碱。,66,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,4吸附柱色谱法用于物质的分离吸附色谱法中硅胶、氧化铝柱色谱在实际工作中用得最多。有关注意事项如下：,67,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(1)硅胶、氧化铝吸附柱色谱过程中，吸附剂的用量一般为试样量的3060倍。试样极性较小、难以分离者，吸附剂用量可适当提高至试样量的1 OO200倍。据此可选用适当规格的色谱管，实验室中常用色谱管的规格如下所示，其高度与直径比(h/d)约为(15：1)(20：1)。谱管内径(cm)：O.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.O 6.0 8.O 10 长度(cm)：10 15 30 45 60 75 90 120 150 吸附柱色谱用的硅胶及氧化铝目前均有市售品，可以过筛选用。通常以100目左右为宜，如采用加压柱色谱，还可以采用更细的颗粒，甚至直接采用薄层色谱用规格，其分离效果可以大大提高.,68,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(2)硅胶、氧化铝吸附柱色谱，应尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解试样，以利试样在吸附剂柱上形成狭窄的原始谱带。如试样在所选装柱溶剂中不易溶解，则可将试样用少量极性稍大溶剂溶解后，再用少量吸附剂拌匀，并在60下加热挥尽溶剂，置P205真空干燥器中减压干燥，研粉后再小心铺在吸附剂柱上。,69,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(3)洗脱用溶剂的极性宜逐步增加，但跳跃不能太大。实践中多用混合溶剂，并通过巧妙调节比例以改变极性，达到梯度洗脱分离物质的目的。一般，混合溶剂中强极性溶剂的影响比较突出，故不可随意将极性差别很大的两种溶剂组合在一起使用。实验室中最常应用的混合溶剂组合如表1.6所示。,70,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(4)为避免发生化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质则宜用氧化铝进行分离。当然，硅胶、氧化铝用适当方法处理成中性时，情况会有所缓解。通常在分离酸性(或碱性)物质时，洗脱溶剂中分别加入适量醋酸(或氨、吡啶、二乙胺)，常可收到防止拖尾、促进分离的效果。,71,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(5)如液一液分配色谱中所述，吸附柱色谱也可用加压方式进行，溶剂系统可通过TLC进行筛选。但因TLC用吸附剂的表面积一般为柱色谱用的二倍左右，故一般TLC展开时使组分比值达到O.2O.3的溶剂系统可选用为柱色谱分离该相应组分的最佳溶剂系统。,72,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,5聚酰胺吸附色谱法 聚酰胺(poliamide)吸附属于氢键吸附，是一种用途十分广泛的分离方法，极性物质与非极性物质均可适用，但特别适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物,73,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(1)聚酰胺的性质及吸附原理：商品聚酰胺均为高分子聚合物质，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。聚酰胺吸附物质的原理可用图1.19表示。,74,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,聚酰胺吸附色谱的原理,75,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。,76,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附即相应减弱。,77,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱。,78,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,以上是仅就化合物本身对聚酰的亲和力而言。但吸附因为是在溶液中进行，故障剂也会参加吸附剂表面的争夺，或通过改变聚酰胺对溶质的氢键结合能力而影响吸附过程。显然，聚酰与酚类或醌类等化合物形成氢键缔合的能力在水中最强，在含醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱，在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合。故在聚酰胺柱色谱分离时，通常用水装柱，试样也尽可能做成水溶液上柱以利聚酰胺对溶质的充分吸附，随后用不同浓度的含水醇洗脱，并不断提高醇的浓度，逐步增强从柱上洗脱物质的能力。甲酰胺、二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中均有酰胺基，可以同时与聚酰胺及酚类等化合物形成氢键缔合，故有很强的洗脱能力。此外，水溶液中加入碱或酸均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合，也有很强的洗脱能力，可用于聚酰胺的精制及再生处理。常用的聚酰胺再生剂有1O醋酸、3氨水及5氢氧化钠水溶液等。,79,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,综上分析，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强，可大致排列成下列顺序：水 甲醇 丙酮 氢氧化钠水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液,80,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(2)聚酰胺色谱的应用：如上所述，聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是可逆的(鞣质例外)，分离效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色谱特别适合于该类化合物的制备分离。此外，对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。另外因为对鞣质的吸附特强，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脱鞣处理特别适宜。聚酰胺色谱也有薄层色谱与柱色谱两种方式。,81,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,6大孔吸附树脂 大孔吸附树脂一般为白色球形颗粒，通常分为非极性和极性两类。因其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒中，所以在天然化合物的分离与富集工作中被广泛应用。对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物的影响。,82,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(1)大孔吸附树脂的吸附原理：大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料，它的吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。分子筛性是由于其本身多孔性结构的性质所决定。,83,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,特性：理化性质稳定，不容于酸、碱及有机溶剂。对有机物选择性较好。吸附速度快。再生处理方便。,84,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,吸附原理：吸附性：大孔吸附树脂本身具有吸附性，是由范德华力或氢键吸附的结果。筛性原理：是由大孔吸附树脂本身的多孔性所决定的。,85,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(2)影响吸附的因素：比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键等是影响吸附的重要因素。一般非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性树脂则易在水中吸附极性物质。糖是极性的水溶性化合物，与D型非极性树脂吸附作用很弱。据此经常用大孔吸附树脂将中药的化学成分和糖分离。溶剂的性质是另一个影响因素。物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小，反之就大。例如用非极性大孔吸附树脂对生物碱的O5盐酸溶液进行吸附，其吸附作用很弱，极易被水洗脱下来，生物碱回收率很高。化合物的性质也是影响吸附的重要因素。化合物的分子量、极性、能否形成氢键等都影响其与大孔吸附树脂的吸附作用。分子量小、极性小的化合物与非极性大孔吸附树脂吸附作用强。另外，能与大孔吸附树脂形成氢键的化合物易被吸附。,86,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,影响大孔吸附树脂分离效果的因素：化合物分子极性大小：一般来说，大孔树脂的色谱行为具有反相的性质。被分离物质的极性大先流出色谱柱。分子体积大小：在一定条件下，化合物体积越大，吸附力越强。,87,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(3)大孔吸附树脂的应用：大孔吸附树脂现在已被广泛应用于天然化合物的分离和富集工作中，如苷与糖类的分离、生物碱的精制。在多糖、黄酮、三萜类化合物的分离方面都有很好的应用实例。市售大孔树脂一般含有未聚合的单体、致孔剂(多为长碳链的脂肪醇类)、分散剂和防腐剂等，使用前必须经过处理。大孔吸附树脂的预处理：以乙醇湿法装柱，继续用乙醇在柱上流动清洗，不时检查流出的乙醇，当流出的乙醇液与水混合不呈现白色乳浊现象即可，然后以大量的蒸馏水洗去乙醇。,88,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(4)洗脱液的选择：洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。根据吸附作用强弱选用不同的洗脱液或不同浓度的同一溶剂。对非极性大孔树脂，洗脱液极性越小，洗脱能力越强。对于中等极性的大孔树脂和极性较大的化合物来说，则选用极性较大的溶剂为宜。一般上样后先用水（或酸、碱水）洗去杂质，然后用不同浓度的含水醇、甲醇、乙醇、丙酮等依次洗脱。,89,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,(5)应用实例：甜叶菊苷的提取分离,90,(四)根据物质分子大小差别进行分离,天然有机化合物分子大小各异，分子量从几十到几百万，故也可据此进行分离。常用的有透析法、凝胶滤过法、超滤法、超速离心法等。前两者系利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网状结构的分子筛滤过作用；超滤法则利用因分子大小不同引起的扩散速度的差别；至于超速离心法则系利用溶质在超速离心作用下具有不同的沉降性或浮游性。以上这些方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类的脱盐精制及分离工作，对分离小分子化合物来说不太适用。可是凝胶滤过法不然，它可用于分离分子量1 000以下的化合物。,91,(四)根据物质分子大小差别进行分离,1凝胶滤过法分离物质的原理 凝胶滤过法(Gel filtration)也叫凝胶渗透色谱(Gelpermeation chromatography)、分子筛滤过(molecular sieve filtration)、排阻色谱(exclusion chromatography)，系利用分子筛分离物质的一种方法。其中所用载体，如葡聚糖凝胶，是在水中不溶、但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。,92,(四)根据物质分子大小差别进行分离,1凝胶滤过法分离物质的原理 当在水中充分膨胀后装入色谱柱中，加入试样混合物，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部(即被排阻在凝胶粒子外部)，故在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先行流出；小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱时阻力增大、流速变缓，将较晚流出。试样混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到动态平衡后，即按分子由大到小顺序先后流出并得到分离(图）,93,(四)根据物质分子大小差别进行分离,1凝胶滤过法分离物质的原理,凝胶色谱简单原理图,1待分离的混合物在色谱床表面 2试样进入色谱床，小分子进入凝胶颗粒内部，大分子随溶液流动 3大分子物质行程短，流出色谱床，小分子物质仍在缓慢移动,94,(四)根据物质分子大小差别进行分离,以上情况可用下式作进一步说明。假定从柱上加入试样算起，至某个组分集中流出时所需溶剂体积为Ve(称为洗脱体积)，则Ve与组分分子量之间有下列关系。Ve=Kl-K2lgM 因K1、K2均为常数，故洗脱体积(Ve)取决于分子量(M)的大小。M越大，则Ve越小；M越小，则Ve越大。由此进一步说明了凝胶滤过的洗脱规律。一般，分离条件一定时，Ve重现性很好，可用来表示物质的洗脱性质。,95,(四)根据物质分子大小差别进行分离,2凝胶的种类与性质 商品凝胶的种类很多，常用的有 葡聚糖凝胶(sephadex G)以及 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)。,96,(四)根据物质分子大小差别进行分离,(1)葡聚糖凝胶：系由平均分子量一定的葡聚糖及交联剂(如环氧氯丙烷)交联聚合而成。其部分结构如下图所示。生成的凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量及反应条件。加入的交联剂数量越多即交联度越高，网孔越紧密，孔径越小，吸水膨胀也越小；交联度越低，则网孔越稀疏，吸水后膨胀也越大。商品型号即按交联度大小分类，并以吸水量多少表示。以sephadexG-25为例，G为凝胶(Gel)，后附数字=吸水量1 O，故G-25示该葡聚糖凝胶吸水量为2.5 ml/g。,97,(四)根据物质分子大小差别进行分离,交联葡聚糖的化学结构,Sephadex G型只适于在水中应用，且不同规格适合分离不同分子量的物质,98,(四)根据物质分子大小差别进行分离,交联葡聚糖凝胶的性质,99,(四)根据物质分子大小差别进行分离,(2)羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)：为sephadex G-25经羟丙基化处理后得到的产物。此时，葡聚糖凝胶分子中的葡萄糖部分将与羟丙基结合成下列醚键形式：,100,(四)根据物质分子大小差别进行分离,与sephadex G比较，sephadex LH-20分子中-OH基总数虽无改变，但碳原子所占比例却相对增加了。因此与sephadex G不同，不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用。下表为sephadex LH-20在不同溶剂中湿润膨胀后得到的柱床体积及保留溶剂数量。,101,(四)根据物质分子大小差别进行分离,sephadex LH-20对各种溶剂的保留量,102,(四)根据物质分子大小差别进行分离,sephadex LH-20除保留有sephadex G-25原有的分子筛特性，可按分子量大小分离物质外，在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的效果，适用于不同类型有机物的分离，在天然药物分离中得到了越来越广泛的应用。其中，d1-去甲乌药碱(d1-demethylco-claurine)的分离实例可以代表sephadex LH-20用于物质分离的一般操作过程。Sephadex LH-20价格比较昂贵。用过的sephadex LH-20可以反复再生使用，而且柱子的洗脱过程往往就是柱子的再生过程。暂时不用时可以水洗。含水醇洗(醇的浓度逐步递增)_醇洗，最后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时，可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，6080干燥后保存。,103,(四)根据物质分子大小差别进行分离,此外，商品凝胶还有丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P)、琼脂糖凝胶(sepharose Bio-Gel A)以及结合了不同离子交换基团的葡聚糖凝胶衍生物，如羧甲基交联葡聚糖凝胶(CM-sephadex)。二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶(DEAEsephadex)、磺丙基交联葡聚糖凝胶(SP-sephadex)及苯胺乙基交联葡聚糖凝胶(QAEsephadex)等，分别具有不同的特色及应用范围，有关专著中均有记载，可以参阅利用。,104,(五)根据物质离解程度不同进行分离,天然有机化合物中，具有酸性、碱性及两性基团的分子，在水中多呈离解状态，据此可用离子交换法或电泳技术进行分离。以下仅简单介绍离子交换法。,105,(五)根据物质离解程度不同进行分离,1离子交换法分离物质的原理：离子交换法系以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱。当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换的化合物将通过柱子从柱底流出，而具有可交换的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件，并用适当溶剂从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。,106,(五)根据物质离解程度不同进行分离,2离子交换树脂的结构及性质