动物细胞与组织培养技术.ppt

第三章 动物细胞与组织培养技术,第一节 概述 一、动物细胞与组织培养的基本概念 二、动物细胞体外培养的特点 三、发展历史 四、动物细胞的体外培养一般条件(掌握）五、体外培养细胞生物学特性(掌握）第二节 动物细胞、组织培养的基本方法(掌握）第三节 培养细胞的检测和特性鉴定(掌握）第四节 动物细胞体外培养举例 第五节 细胞同步化（了解）第六节 组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）,第一节 概述,一、基本概念1动物细胞与组织培养(Cell and Tissue Culture)：指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。是动物细胞工程的基础。,分类：细胞培养 组织培养 器官培养,2、原代培养(Primary Culture)：亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。3继代培养（Secondary Culture）：亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.4、细胞系(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。5、细胞株(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。,有限细胞系(infinited cell line)：不能连续培养的细胞株。,无限细胞系(finited cell line)：能够连续培养的细胞株，也称无限系。无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞。,细胞株、细胞系的命名：以组织来源定名，如BHK(幼地鼠肾细胞)以人名定名，如HeLa细胞以时间地点来定名，如S7811细胞系以临床疾病类型定名，如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞),用于生产的动物细胞株,原代细胞,二倍体细胞,融合细胞,基因工程细胞,转化细胞,常用细胞株：CHO细胞、Vero细胞、BHK-21细胞、WI-38细胞,二、动物细胞体外培养特点动物细胞生长缓慢，培养时间长。更易受微生物污染（包括细菌、真菌、病毒、支原体），需要防治污染问题。对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括PH值、温度、剪切力对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。,平滑肌细胞,神经元细胞,血红细胞,形态上表现为多种多样，如圆形、椭圆形、正方形、柱形、扁平形、梭形、星形和多边形等,三、动物细胞培养的发展历史,1885年，Wilhelm Roux（劳斯，德国）最先尝试离体培养鸡胚神经存活了一段时间。并且，他首次采用了“组织培养”一词。1907年，美国胚胎学家Ross Harrison（哈里森）培养蛙胚神经细胞长出了轴突（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）。他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。1912年,法国学者Alexis Carrel（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。1923年，他设计了卡氏培养瓶。,1913年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。1925年，Maximow采用双盖片法。1934年，Gey和Lewis 用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计了多种类型的培养瓶。1948年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创建了单个细胞培养方法。1951年，Pomerat设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究1951年，厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。,1952年Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌Hela细胞系。1960年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。1962年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。,四、动物细胞的体外培养一般条件,1、恒定的温度:37,维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43以上1小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低,2、pH：最适为7.27.4,大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是，每种细胞都有其最适pH值.当PH低于6或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。,3、气体,气体：需要O2、CO2（95%空气、5%CO2）气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中.二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.,4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子等。,5、无菌培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。,（一）培养细胞的生长方式及类型,（二）培养细胞的生长特点,（三）培养细胞的生长与增殖过程,五、动物细胞的体外培养生物学特性,贴壁依赖型细胞,非贴壁依赖型,成纤维细胞,上皮型细胞,游走型细胞,多形型细胞,（一）培养细胞的生长方式及类型,于悬浮状态下即可生长,贴附于支持物表面才能生长的细胞,1、贴壁依赖型细胞含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外基质结合。单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。,在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞（1）成纤维细胞型：本型细胞的形态似在体内生长的成纤维细胞；长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核位于中央，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向，细胞间间隙较大。其生长特点为细胞一般并不紧靠相连；中胚层细胞体外培养时一般表现为这一形式。如人胚肺细胞。,人的成纤维细胞,小鼠的成纤维细胞,人骨髓间充质细胞（MSC）,大鼠血管平滑肌细胞,成纤维细胞型,成纤维型细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名.除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。,（2）上皮型细胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，不规则。细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有扁圆形核，细胞彼此紧密相连成单层细胞，呈现“铺路石状”。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。内胚层和外胚层细胞体外培养时都可能呈现上皮型。如皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮细胞等。Hela细胞呈现为典型的上皮细胞型。,单层扁平上皮细胞,人口腔皮样癌细胞,人宫颈癌上皮细胞（Hela）,成骨肉瘤细胞(多角形),上皮细胞型,奶牛肾脏上皮细胞(上皮细胞型),体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；而且，这种名词系使用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源。与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态要有差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的方向可能并不相同。,（3）游走型细胞：,不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。,体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。主要是：单核巨噬细胞系统的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。,1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；2、细胞胞质常伸出伪足和突起。3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、方向不规则。4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。,单核巨噬细胞（未刺激状态）,游走细胞型,单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：向四周伸展伪足,需要注意的是：在实际细胞培养中，可能同时存在2种及其以上细胞形态；其影响因素包括（1）不同来源细胞细胞形态学表现不同；（2）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如血清成分，培养基，温气环境等,（4）多形型细胞：形态上不规则的细胞，不常见，一般分胞体和胞突两部分，胞突细长形类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则。如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。,神经细胞（DAB显色）,多形型细胞,神经细胞,大鼠 海马神经细胞,2 非贴附型细胞 悬浮型细胞：指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这种细胞的形态特点：胞体始终为球形。优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收获细胞。缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长。贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养,实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种典型的形态，能影响细胞形态的因素很多，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标，如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。,影响细胞形态学特征的因素,血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。如,Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞,但在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形,当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。,(二）培养细胞的生长特点,贴附和伸展,接触抑制,密度抑制,1贴附 贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。贴附底物：其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。一类特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素、型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。细胞贴附和伸展过程：,贴附过程：促细胞附着因子吸附于底物上 悬浮的圆形细胞与底物附着 细胞将伸展成其原来的形态。,贴附过程,影响细胞的贴附和伸展的因素：细胞因素；生物因素（如促附着因子）；机械、物理因素（如低温或培养液的流动过快)；其它一些因素的影响（例如：离子的作用).可采取的措施：包被；减少接种时细胞悬液的量；培养液中离子成分及浓度培养液的温度,2接触抑制（Contact inhibition）细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。,3、密度依赖性（Density inhibition）3T3细胞系，在细胞稀少状态下培养时，其生长迅速；但一旦细胞生长汇合成一片时（每6cm培养皿约106个细胞），其分裂增殖停止。其确切的细胞密度常与培养液中的血清浓度有关。上述这种生长特性即为密度依赖性调节（或密度抑制）。转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同，他们的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长至较高的终末细胞密度。,（四）体外培养细胞的生长与增殖过程 1、单个细胞的生长过程：与体内细胞周期相似，经历G1、S、G2、M期。,细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为1248h，细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2）分裂期（M）,体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段,原代培养期,传代期,衰退期,2、细胞系的生长过程：,(1)原代培养（初代培养）为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段,一般持续14周。特点：原代细胞培养通常为异质性，细胞独立生存性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性，是检测药物的很好实验工具。,(2)传代期 当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。特点:在细胞整个生命期中此期的持续时间最长，一般情况下，可传代1050代。细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，被称为二倍体核型。,有限细胞系和永久细胞系 动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（primary culture）。经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有限细胞系：细胞自动物体内取出后，在培养中仅持续生长有限时间，然后将自行停止生长。即使提供生长所需的营养物质（包括血清），最终也会死亡。这种寿命仅能维持一段时间的细胞系，称为有限细胞系。大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。,荧光原位杂交显示端粒,结果：细胞群体中具有迅速增殖能力的细胞将渐占优势而非增殖的或增殖缓慢的细胞将被减弱。,(3)衰退期，此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。细胞在第二期末或第三期初阶段，通过所谓“危机期”(crisis)，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。,3、每代细胞的生长过程,在细胞的生长过程中，繁殖到一定密度后，将之分开而移至新的培养皿中称为接种。细胞”一代”：仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间。,潜伏期,每代细胞的生长阶段：,指数生长期,停止期,培养细胞传代的生存期：1)潜伏期(latent phase)2)指数生长期(logarithmic growth phase)又称对数期-试验用3)平台期又称生长停滞期(stagnate phase)。-传代,1）潜伏期,2）指数生长期,细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。持续35天。细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，渐次铺满培养器皿底物，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终止分裂。细胞不再繁殖而进入平台期。,3 平台期,又称生长停滞期。此期细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞量和密度达到饱和，细胞停细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖，细胞数量持平。特点细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。,第二节 动物细胞、组织培养的方法,一、体外培养的一般过程二、动物细胞培养的基本方法 三、动物细胞大规模培养技术 四、动物细胞体外培养举例 五、动物细胞体外培养现状与展望,一、体外培养的一般过程,体外细胞培养一般过程：组织获得 组织消化 接种培养传代及细胞冻存复苏等,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬液,胰蛋白酶,1代细胞,原代培养,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,动物细胞培养的基本过程,过程,组织取材,组织细胞的分离,培养,机械法,消化法,机械法分离胚胎,（二）、原代培养与传代培养技术 1、原代培养分为两种：1）组织块培养法 2）组织消化培养（单层培养法）：适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝肾及传代细胞等。一般而言幼体组织比老龄组织，分化低的比分化高，肿瘤组织比正常组织易于培养。,（一）取材,基本步骤：无菌取出目的组织,用利刀无菌切割成12mm小块,以Hanks液漂洗干净,低速离心，弃上清,移入培养瓶，加入适当培养基浸润,培养瓶翻转1800，置1530分，使其贴壁,培养瓶翻回，置于37培养,（1）组织块培养,组织块培养法,a：取材修剪冲洗b：剪切成1mm3左右的小块c：移入培养瓶d：分布组织小块间距5mme：翻转培养瓶并加培养液37静止1-2hf：翻正培养瓶进行培养g：原代细胞生长,取材分离和组织消化,无菌取出目的组织,用利刀无菌切割成细块,胰蛋白酶液消化,Hanks液漂洗两次，低速离心弃上清,吸管吹打分散细胞,移入培养瓶薄层培养,(2)组织消化培养,加入30-50倍体积0.25%浓度胰蛋白酶溶液,37消化30-60min，每5-10min摇动一次,相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等，需根据酶及组织成分的特点选择使用,原代培养与检查 接种、培养 常规检查（检查细胞形态及活力、检查营养液pH及污染）,2、传代培养技术传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养，这一操作过程成为传代。第一次传代时间：有80-90%或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态不佳。,基本步骤：,吸出培养瓶内旧培养液,加入胰蛋白酶和EDTA混和液(以能覆盖整个瓶底为准）,吸出消化液，加入培养液终止消化,吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数,重新接种于新的培养瓶内,1）贴壁生长细胞传代,培养,2）悬浮生长细胞传代,离心法传代,直接传代法,离心法传代：离心（1000转/分-800g）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。,直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。,（三）细胞纯化,（四）细胞的冻存复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。1、冻存意义：1）长期保存细胞；2）防止细胞老化；3）减少人力、经费，减少污染。,2、冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。在细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,3、保存细胞三要素：营养、保护剂和低温,低温保护剂的应用在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是甘油或DMSO，渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。保护剂的浓度在515%之间，常用10%。,4、慢冻程序,标准程序：当温度在-25 以上时，12/min 当温度达-25 以下时，510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,细胞冻存方法,1预先配制冻存液：含20%血清培养基 9份 DMSO 1份2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)3 分装：每瓶1ml，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4、冻存,1)传统方法：冷存管置于410分钟-2030分钟-801618小时(或隔夜)液氮槽长期储存。-20不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。(2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3/分钟之速度由室温降至(-80以下)-120，再放在液氮长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。,冻存要点：1）慢冻2）取对数生长期细胞进行冻存，无微生物污染；3）细胞浓度：达到10 6/毫升 4）合适的冷冻保护剂：DMSO,常用10%。5）使用高浓度血清,5、细胞复苏方法,与快速融化的手段，以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。程序：（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,二、动物细胞培养的基本方法 悬滴培养法 旋转管培养法 灌注小室培养法 培养瓶培养方法 培养板培养法 克隆培养法,1、悬滴培养法 悬滴培养法：又称植块悬滴培养法，1907年，哈里森首创。即将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂于盖玻片下，再置于一凹形载玻片上，最后用熔蜡密封后放于培养箱中培养。优点：1）容易换片。2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。,2、旋转管培养法 盖尔（Gey，1933年）、刘易斯（Lewis，1934年）建立该方法。特点：是培养中组织块或细胞交替地与培养液和空气直接接触。包括旋转管、旋转鼓、支架等。缺点：不易在显微镜下观察。,3、灌注小室培养法 在盖玻片悬滴法基础上发展而来，可用于连续观察细胞动态变化，研究各种因素影响作用及活细胞反应。1912年由Burrows首创。,4、培养瓶培养方法 培养瓶培养方法：指将培养对象直接接种于培养瓶内培养。1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶。Earle设计了T-培养瓶。采用的材料对细胞无毒，透明。,悬浮细胞培养瓶,滚动培养瓶,盖玻片+培养瓶培养法：先以盖玻片为生长表面，将拟培养细胞或组织接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行培养。优点：1）可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响2）可以方便显微观察、染色等操作，以及永久保存；3）增加了培养瓶培养面积。,5、培养板培养法 培养板培养法又称微量培养法。一般是一次性使用,6、克隆培养法,就是将细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁殖成一个新的细胞群体的培养技术,过程:,制细胞悬液,连续稀释获得单细胞,单细胞接种,培养,细胞株:由细胞系进一步克隆化，而获得的由单一细胞形成的细胞群体。,动物细胞大规模培养技术 动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养和悬浮培养法基础上，再融合固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应器、人工灌流技术等发展起来的。（一）培养方法 转瓶培养 反应器贴壁培养悬浮培养技术 微载体培养技术 多孔载体培养 微囊化培养技术 中空纤维法,固定化培养,1、反应器贴壁培养 此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。,2、悬浮培养技术,适于少数悬浮生长型细胞,3、微载体培养技术1967年，Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞，以直径60-250um微珠作为微载体。原理：其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。理想的细胞支持物特征：生物相容性；无毒害；好的传质特征；机械稳定性好；比表面大，适于细胞生长；颗粒均一；能高压灭菌；可重复利用，易清洗；接种方便；能固定大部分细胞，能保护细胞，易使细胞、载体和培养基分离；适合贴壁细胞和悬浮细胞培养。,微载体系统培养细胞具体步骤 p110,选择合适的微载体类型,浸泡水化及消毒,接种,培养观察和细胞计数,消化,分离细胞,传代培养,交联葡萄糖DEAE-纤维素蛋白质：变性胶原高分子材料：硅胶、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯无机玻璃基质,常用商品化微载体有三种：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。,多孔载体培养,优点：易固定化、比表面大、细胞在载体内生长，免受机械损伤；可以提高通气量，强化传质。适用于贴壁细胞培养、悬浮细胞固定化连续灌流培养和大规模高密度培养系统。,多孔载体材料要求：生物相容性、机械稳定性、热稳定性,4、微囊化培养技术 人造的半透膜制成的多孔微球体，借鉴固定化技术将细胞包裹在微囊内。适用于单克隆抗体、干扰素等的制备。微囊直径控制在200-400m为宜。制备中应注意：温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；所用试剂和膜材料对细胞无毒害；膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。,5、中空纤维法Richard Kncazek 1972年发明。最初使用醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成海绵状多孔结构。可以模拟细胞体内三维状态。目前材料有：硅胶、聚丙烯等。优点是：占地空间少；细胞产量高，细胞密度可达109数量级；生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞,动物细胞培养的产物,（二）动物细胞生物反应器培养（）1、生物反应器的特点分析 反应器主要结构形式：搅拌式 气升式 固定床式技术要求：能提供均匀温和的混合状态，剪切力小，传质效果好；反应器空间利用率高，选用合适载体系统和材料；能保证严格无菌；能控温、酸碱、溶氧和CO2浓度等；能方便快捷实现培养液连续添加，样品采集和观察。,2、生物反应器应用概况*动物细胞培养常用的生物反应器：柱状中空纤维反应器 板框式中空纤维反应器 中心灌流式反应器 灌流微载体生物反应器 旋转壁式反应器,（三）动物细胞大规模培养操作方式,分批式操作,流加式操作,半连续式操作,连续式操作,灌流式操作,优点：操作简单，培养周期短，污染和细胞突变的风险小。缺点：费用高，每一次收液后，都要进行一系列新的接种放大的准备工作，此期间生产停工。而且收液率低.,优点：生产效率高，可反复长期培养，反复收获产品。,优点：反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定的状态下生长。缺点：开放式操作，容易造成污染。细胞容易发生变异，且对设备等要求高。,优点：培养状态恒定，细胞在稳定的状态下生长。产量高等.,（四）、动物细胞生物反应器大规模培养 产品1、应用 病毒疫苗：乙肝、脊椎灰质炎和狂犬疫苗等非抗体免疫调节剂：干扰素、白细胞介质、B细胞生长因子、巨噬细胞激活因子、T细胞替代因子等多态生长因子：神经、成纤维、表皮、血清生长因子等酶类：组织血纤维酶原激活剂激素：红细胞、促黄体生成素、促滤胞素肿瘤特异性抗原：癌胚抗原单克隆抗体病毒杀虫剂：杆状病毒,2、关键技术 细胞培养环境：氨离子、乳酸、二氧化碳、甲基乙二醛、渗透压、载体细胞死亡与凋亡：基因工程的调控培养基与细胞系：无血清培养基的研发，基因工程的应用 过程监控：在线氧吸收速率、葡萄糖分析，亲和层析与在线取样系统偶联等,第三节 培养细胞的检测和特性鉴定,一、培养细胞的常规检查 细胞接种或传代以后，在生存期间，实验者每天或至多间隔1-2天，要对细胞做常规性检查.观察的结果是：污染与否，细胞生长和pH等情况，随时掌握细胞动态变化，以便做换液或传代处理，如发现异常情况应及时采取措施。,1、细胞形态 生长状态良好的细胞，在一般显微镜下观察时透明度大，轮廓不清，只有用相差显微镜，才能看清细胞的细微结构。细胞机能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点，如上皮细胞变成类纤维细胞等。只有状态良好的细胞才宜利用进行实验。在很多情况下，细胞虽机能状态不良，但仍可生长，如支原体轻度污染时即如此。因此生长与否尚不能作为判定细胞好坏的唯一标准，必须做全面分析。,2、细胞生长情况很多情况下，开始从组织最先“长”出的为游走细胞，它们单独活动，形态不规则，用缩时逐格显微电泳法可揭示出它们极活跃的变形、游走和吞噬活动。在游走细胞之后，接着出现的是成纤维细胞或上皮细胞。说细胞“生长”不如说移动更为恰当，因这时尚很少见细胞分裂，仅有细胞运动而已。只有当细胞分裂出现后，细胞数量逐渐增多，形成较大的生长晕或连接成片时，才真正进入了生长状态。,3、培养液 在正常情况下，培养液呈桃红色。用一般温箱培养时，随细胞生长时间的延长，CO2积累增多，在超越缓冲范围后，营养液酸化变黄，如不及时调节PH，对细胞会发生不利影响，严重时细胞脱落死亡。培养液中加Hepes或用CO2温箱培养可使PH维持稳定。用磷酸盐缓冲系统时，可因瓶口漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶和瓶塞洗刷不洁残留碱性物，使之变碱发红。更换营养液时间，可依营养物的消耗而定，细胞生长旺盛时天换一次，生长缓慢时，天亦可。,4、微生物污染 在长时间多量培养工作中，即使用品消毒操作严密，亦难避免偶尔发生污染。,污染的途径,污染途径-空气、器材、操作、血清、组织样品污染对培养细胞的影响及检测体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救。,1）细菌的污染及检测多数培养细胞在遭到细菌的污染后，培养液短期内颜色变黄，产生大量酸性物质，出现明显混浊现象，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。培养检测，可以取少量培养液涂布在无菌琼脂培养基上，过夜查看。防止，通常在严格的实验操作之外，培养基中加入青霉素、链霉素能够有效的防止细菌污染。,2）真菌的污染检测真菌的污染物通常是培养基表面漂浮的白色及黄色、黑色的小点。在显微镜下可见丝状细胞的交叉。防止，酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要时加入抗真菌剂。,3）支原体的污染和防止 支原体是一种介于细菌和病毒之间、能独立生活的微生物，无细胞壁，直径最小可以达到0.2 m，在0.22m的滤膜过滤仍然有1%左右的支原体可以通过。支原体污染后的培养细胞中没有明显可见的特征，所以很难发现。,相差显微镜检测：将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间；荧光染色法：用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不含酚红的Hanks液漂洗一下，用1：3醋酸甲醇固定10min，然后用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配置浓度为50g/ml的Hoechst33258中染色10min。染色后用蒸馏水洗1-2min，向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。,电镜检查：用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电子密度大的密度颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质，部分种类需要精氨酸、2或葡萄糖，每一种支原体都有自身特点。DNA分子杂交检查或支原体培养等方法：检出率高，但方法较复杂。,4）病毒的污染及检测滤器对病毒没有任何阻挡作用，通常不容易被污染，因为病毒不能在细胞外复制，而且它们通常具有宿主细胞的感染限制。通常其检测方式是抗体检测及PCR检测。细胞交叉污染及检测不容易发生，常见的细胞形态观察可以区分。,污染的预防,培养前培养操作时其他注意事项必要的细胞备份对新引进或构建的细胞株应加强观察，并做必要的支原体和病毒的检查。定期消毒培养箱。,二、培养细胞的生物学鉴定,1、细胞形态观察内容：细胞形态、核质比例、染色质、核仁大小及多少、微丝微管排列状态等方法：倒置相差显微镜、电镜,2、细胞生长情况,细胞生长曲线测定1）、细胞计数法血细胞计数器：人工计数细胞Counter计数仪,用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液.取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。镜下观察计数：计算计数板四角大格内的细胞数，压线者只计算 左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内。,步骤,取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数。如是非贴壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。根据细胞计数结果按每个小方瓶5104mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。,2）、四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪在490nm处检测各孔OD值记录结果，绘制细胞生长曲线,CCK-8试剂盒,原理：Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒）是检一种基于水溶性四唑盐的广泛应用快速高灵敏度检测试剂盒，为MTT法的替代方法，试剂盒中采用水溶性四唑盐在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈良好线性关系。用于测细胞增殖、细胞存活和细胞毒性。,2、细胞分裂指数,体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。,步骤 消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。取出盖片，按下列顺序操作：1）PBS漂洗3分钟甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟Giemsa液染色10分钟自来水冲洗。2）盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。3）计算: