动物繁殖调控技术.ppt

动物繁殖调控技术,人为地调控动物的生殖活动，提高动物生产的效益和质量，使之适合于人们经济发展与维持生态平衡的需要，要求人们加速发展经济动物、观赏动物及保护,濒危动物，这些促进了畜牧兽医工作者对动物生殖进行有效了调控，充分发挥动物的生殖潜力，提高繁殖效率，使之进一步满足人民生活在社会发展的需求。,动物繁殖调控技术,动物繁殖调控技术主要包括：人工授精技术（Artificial Insemination,AI)MOET技术（Multiplovulation and Embryo Transplant,超数排卵与胚胎移植）胚胎体外生产技术（In vitro embryo production,IVP)相关延伸技术（胚胎冷冻、性别鉴定、胚胎分割、胚胎嵌合、细胞核移植和基因导入等）,一、人工受精技术（Artificial Insemination,AI）,1、历史研究1780年，意大利Spallanzani首次用犬进行人工受精，获得成功;1899年，俄国伊万诺夫进行马和牛的AI工作，将犬的假阴道改进成了马、牛、羊用假阴道，并研究精液处理方法，使AI技术进入实际应用阶段;1951年，英国人Polge等将甘油用于-79超低温冷冻保存牛精液并输精，同年产下世界第一头冷冻精液牛犊;1952年，Polge又发表了用经液氮在-192保存9个月鸡精液的受精卵孵化出了雏鸡的报告,一、人工受精技术,2、人工授精技术（AI）AI是借助于器械或徒手操作，以人工和方法采集雄性动物精液，经过精液品质检查、稀释、保存和运输等一系列处理后，再送入到发情雌性动物的生殖道内以达到受胎的目的。这种代替自然交配的技术，称为AI技术。,一、人工受精技术,人工授精技术是由：采精技术（包括采精技术和采精频度）精液处理技术（包括精液品质检查、稀释和保存）输精技术（包括输精的准备、要求和 方法）三部分组成。,一、人工受精技术,2.1采精技术常用的采精方法是：假阴道法此外还有按摩法与手握法。采精频度是指每周对公畜的采精次数。对公牛而言，2-3次/周是较合理的。,一、人工受精技术,2.2精液处理技术精液品质检查的内容有：精液的感官检查精子密度精子活率每头份有效精子数精子畸形率顶体完整率精子存活时间及存活指数伊红低渗溶液试验细菌学检查,一、人工受精技术,精液稀释应在采出的精液经品质检查合格，湿度下降之前及时稀释。AI操作规定每头份输精量中应含有效精子数为：牛1000万-1200万羊5000万-6000万猪1.5亿-2.0亿,一、人工授精技术,液态精液的保存依保存温度可分为：常温保存（15-25）低温保存（0-5）冷冻精液的保存温度为-196,一、人工授精技术,2.3输精技术输精前的准备：凡是接触精液及母畜生殖道的器械使用之前均须洗涤干净并作消毒灭菌处理。精液的准备：用于输精的精液必须按常规进行品质检查，符合AI输精标准。输精母畜的准备：经发情鉴定需要的母畜，一般均采用站立保定。输精方法：牛一般采用直肠把握法，而羊均采用开膣器输精法。,一、人工授精技术,3、人工授精技术的发展前景建立精液基因库普及和研究各种动物的AI技术冷冻精液的生产和使用应规范化加强精液冷冻保存的基础研究,二、MOET技术Multiple ovulation and Embryo Transfer超数排卵与胚胎移,胚胎移植又称为受精卵移植，它的简单含义是：从一头母畜（供体）的输卵管或子宫内取出早期胚胎，移植到另一头母畜（受体）的输卵管或子宫。“借腹怀胎”，以达到产生供体后代的目的。基本过程包括:供体(donor)和受体(recipient)的选择、供体的超排处理及配种、受体同期发情处理、胚胎回收、检卵和移植。,二、MOET技术,历史研究：,二、MOET技术,1、供体和受体的选择1.1供体的选择 首先要考虑其经济价值,只有具有高生产性能的牛才可做为供体 供体牛具有稳定的遗传能力,没有遗传疾病,繁殖机能 旺盛,体质健壮没有任何传染疾病,发情周期正常,发情症状明显,没有流产史和其它一些繁殖机能疾病。年龄选择在15个月龄到10岁以内的供体牛,老龄、太肥、太瘦、长期空怀的母牛不能使用。两次超排处理反映不良的不能使用。分娩6个月以内、3个月以上的母牛繁殖机能旺盛,可以做为主要的供体牛选择对象。,二、MOET技术,1.2受体的选择 受体牛一般选用价格低廉的土种牛 拥有两个以上正常的发情周期,无繁殖疾病,体格健壮,耐病性良好,哺育犊牛能力强 体格标准,符合品种要求 分娩后60天以上的母牛。,二、MOET技术,2、供体的超排处理及配种2.1供体的超排处理(1)+法:根据供体牛体重的大小,在发情后912天肌注25003500,48小时后肌注或宫注2,48小时后观察母牛发情情况,在发情后18小时肌注与等量的,并同时进行人工授精,时隔12小时再输精一次。缺点是供体牛个体反映变异范围较大。,二、MOET技术,(2)法:,二、MOET技术,2.2人工授精 两次授精,以增加获得受精卵母细胞的机会。动物一般在停药后24-48h内有95%的母畜均表现发情。一般上、下午各输1次,因母畜为超排处理.有多个卵子排出，而需加大输精量.用原精的0.2 ml(含4亿精子)/次。如第二次授精时供体牛仍处于发情状态,则须在812h后再进行第三次授精。,二、MOET技术,3、受体同期发情处理 同期发情是利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。当前常用的激素药物有PMSG、GnRH、LHRH、FSH、LH、hCG、PGF2、P4及类似物等。在牛上常用二次PGF2,一般注射后36-48h,有45%60%母牛均表现发情。,二、MOET技术,4、胚胎的收集 目前在牛上常用非手术采集胚胎。用专用的二通或三通硅胶管制品前端有一气囊。冲气后阻止冲胚液流出。冲胚液大多用杜氏磷酸缓冲液(PBS)加5%一10%牛血清白蛋白(BSA)也有加TCM-199的组织培养液的。胚胎采集方法以发情日为第0d,在第7d以手术子宫冲洗法采集胚胎。在此时期,胚胎朝向子宫推进。当冲胚时,将特地配制的冲卵液经导管注入子宫,如此则子宫内的胚胎都集合于冲胚液中,随后再导出于贮液器内,并保存在37条件下,尽量减少体外环境,如温度和灰尘等不良因素的影响。,二、MOET技术,非手术采集胚胎,二、MOET技术,胚胎的收集,二、MOET技术,5、胚胎检测 在显微镜根据胚胎的形态,将胚胎分为四级：A级:胚胎形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,结构紧凑,色调和透明度适中,无附着的细胞和液胞;B级:轮廓清晰,色调和细胞密度良好,可见到少量附着的细胞和液胞,变性细胞约占10%30%;C级:轮廓不清楚,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多,变性细胞约占30%50%;D级:轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液胞很多,变性细胞约占50%80%。,二、MOET技术,八细胞,二细胞,四细胞,十六细胞,二、MOET技术,桑椹胚,囊胚,致密桑椹胚,二、MOET技术,正在孵化的胚胎,有空泡的退化胚胎,二、MOET技术,6、胚胎移植 受体牛在发情后68天之间均可进行移植。移植前对受体进行直肠触摸,检查黄体是否合格。合格受体实行12尾椎间硬膜外麻醉,擦拭外阴部。对照胚龄和受体牛发情阶段,选择适宜的胚胎,将胚胎(冻胚解冻后)装入0.25ml麦管,麦管装入移植枪,将胚胎移植到有黄体一侧子宫角小弯处。,二、MOET技术,羊手术移植,牛非手术移植,三、IVP技术In Vitro Embryo Production胚胎体外生产技术,主要技术环节包括：OPU-IVM-IVF-IVC-ET卵母细胞获取：屠宰场或活体采卵（OVUM PICK-UP,OPU）卵母细胞体外成熟（IN VITRO MATURITION,IVM）精子体外获能（IN VITRO CAPACITITION OF SPERMOTOZA）体外受精（IN VITRO FERTILIZATION,IVF)体外培养（IN VITRO CULTURE）,IVP技术,是指雌雄配子在体外认为操作条件下完成成熟、获能和受精并发育成可移植胚胎的过程。是动物胚胎工程的一项重要技术。人们通过长期研究，已深刻了解到子宫和输卵管的环境，可以模拟该环境建立体外受精条件，从而使卵子和精子在体外能完成受精。这项技术不仅对揭示卵母细胞成熟和受精机理具有重要的理论意义，而且对畜牧业的发展具有广泛的应用前景。,三、体外受精技术,历史研究：哺乳动物体外受精研究已有一百多年历史，自1959张明觉首先把体外受精的兔受精卵移植给受体母兔获得世界上第一个“试管哺乳动物”以来，体外受精技术逐步完善，已相继在30余种哺乳动物上获得成功。,三、体外受精技术,体外受精技术包括四个主要步骤及路线：卵母细胞体外成熟（IVM)精子体外获能（capacitation）体外受精（IVF)早期胚胎发育（IVC）,三、体外受精技术,体外受精主要技术路线,三、体外受精技术,1、精子体外获能（capacitation）定义：哺乳动物的精子在刚射入雌性生殖道时,或从附睾取出时,并不具备受精能力,必需在雌性生殖道内经过一段时间,发生生理及形态学的变化才能获得受精能力,这一现象是被美籍华人科学家张明觉和澳大利亚科学家Austin发现的,后来被Austin称为精子获能(Sperm capacitation),三、体外受精技术,精子获能机制：有能力到达卵母细胞并穿过透明带;有能力进行获能和顶体反应;成熟过程中获得的蛋白结合位点，能适时暴露给卵母细胞以结合透明带;可以与卵母细胞膜融合并且将遗传物质注入到卵子的细胞质中。精子通过附睾时已经获得上述大部分能力。,三、体外受精技术,精子体外获能一般分为两步：一是精子的洗涤：经一次或多次离心后除去杂质、精清、死精子、低活力的精子、冻精保护液及稀释液等;二是精子的获能处理：主要是使用高离子强度液，钙离子载体，肝素和BSA等，以促使Ca2+进入精子顶体并刺激精子内部pH升高，从而诱发精子获能。,三、体外受精技术,2、卵母细胞体外成熟（IVM)卵母细胞体外成熟是哺乳动物体外受精技术的关键步骤之一,它直接关系到体外受精技术的成功与否。卵母细胞在体外条件下，可自发地完成核成熟，并且可以明显地观察和记录。为了提高卵母细胞在体外成熟的效率，研究者们研究了许多与卵母细胞体外成熟相关的因素：,三、体外受精技术,2.1卵母细胞类型一般以卵母细胞周围卵丘细胞形态对卵母细胞进行分类：A 类:由致密多层卵丘细胞层包裹的卵母细胞;B 类:卵丘细胞层不完全的卵母细胞;C 类:完全裸露的卵子;D 类:卵丘细胞层呈蜘蛛网状附着的卵母细胞。其中A、B类卵母细胞胞浆均匀并充满于透明带内，在IVM中一般选用这两类卵母细胞作为体外培养的对象。,三、体外受精技术,卵母细胞类型,Required Factors For Oocyte Growth In Vitro,Culture System Mammalian Oocyte,三、体外受精技术,2.2基础培养基目前，在卵母细胞的基础培养体系中的最为广泛的是TCM199，其缓冲体系以Hepes或碳酸氢盐(Earles salts)为好，磷酸盐缓冲系(Hanks)较差。应用TCM199对牛、猪、绵羊、山羊的卵母细胞进行体外培养依据实验设计及条件等多方面的影响，均有60%90%的成熟率。,三、体外受精技术,2.3基础培养体系的添加物 现在研究者一般都通过向成熟培养液中添加一种或几种适当的成分，如激素、血清、卵泡液、生长因子及颗粒细胞等，以模拟卵母细胞体内成熟时的环境及各种成分间的相互作用，改善体外培养条件，达到获得正常受精率和发育率的目的。,三、体外受精技术,2.4其他因素卵巢所处性周期的影响 年龄的影响卵巢运输时间和温度的影响 不同季节的影响卵母细胞成熟培养温度和时间的影响水质的影响,三、体外受精技术,2.5卵母细胞成熟的特征 染色体凝集（GVBD）第一极体排出透明带软化卵丘细胞扩展,成熟的卵母细胞,三、体外受精技术,2.6亟需解决的问题 目前亟需解决的问题是卵母细胞核质成熟同步化。减数分裂的完成标志着卵母细胞核的成熟。而卵母细胞质的成熟不仅有细胞器超微结构的改变，而且还发生了诸多、渐变的细胞质内部的生理生化变化。卵母细胞体外成熟的核心问题是如何实现核质成熟的同步化。体外核成熟完成并不能保证细胞质的正常成熟，细胞核和细胞质的成熟具有协调性。,三、体外受精技术,3、体外受精（IVF）成功的体外受精不仅依赖卵母细胞的成熟和精子的获能,而且精子浓度、精卵相互作用时间、培养液和温度也是重要的影响因素。,三、体外受精技术,3.1精子浓度 在IVF中精子密度通常为0.5106-5.0106/ml。受精过程一般在石蜡油或硅酮油覆盖下的微滴中进行，微滴以50100l为宜。密度超过1.6106个/ml则多精受精现象增加。,三、体外受精技术,3.2精卵相互作用时间 精卵作用时间与受精体系有关，BO液中需68h，而TALP中则需1824h，时间太短受精率下降，时间太长则多精受精数增多。精卵共同孵育不足16h则会降低受精率。,三、体外受精技术,3.3受精液和温度 最常用的牛精子洗涤液为BO液和改良的台氏液（m-Tyrodes，TALP）两大类液。培养条件是5%CO2的空气、37-38.5、100%的相对湿度。,三、体外受精技术,3.4多精受精 长期以来多精子受精问题一直是体外受精的一个难点。(尤其在猪)据研究分析其卵子在体外受精时不能有效地阻止多精子穿入的主要原因,是体外受精卵子分泌的皮质颗粒,在卵黄隙之间不能象在输卵管内那样很好的扩散。所以,如何使体外受精环境更类似于体内,还有待于进一步探讨。,三、体外受精技术,4、早期胚胎体外发育（IVC)受精卵须在培养液(或输卵管)中发育到桑椹胚或囊胚后移植到受体,才能获得较高的妊娠率。早期胚胎体外发育中的主要问题：早期胚胎体外发育培养系统早期胚胎体外发育阻滞,三、体外受精技术,4.1早期胚胎体外发育培养系统 目前，体外早期胚胎培养系统可以分为两种：即合成液培养系统和共同培养系统。合成培养系统 利用成分确定的合成培养液，如TCM199，CRlaa或SOF等，添加血清、BSA、维生素、氨基酸、抗氧化剂等物质。该系统成分明确，便于研究胚胎发育过程中每一种物质对胚胎的作用机制，有助于了解胚胎早期发育的机理，但桑椹胚和囊胚发育率不高。,三、体外受精技术,共同培养系统 利用体细胞在体外与受精卵共同培养，促进胚胎发育，可以获得较高的囊胚发育率。目前用于共同培养的体细胞主要有：输卵管上皮细胞（BOEC）颗粒/卵丘细胞（GCs），子宫内膜细胞，成纤维细胞和水牛大鼠肝细胞（BRL）等。其中以颗粒细胞，输卵管细胞共培养应用最为普遍。,三、体外受精技术,4.2早期胚胎发育阻滞 早期胚胎发育阻滞是一个普遍存在的现象，与胚胎基因组的启动或激活密切相关。因动物种类不同，早期胚胎发育阻滞时间有所差异。牛和绵羊发生在816细胞期;兔发生在16细胞期;人发生在48细胞期。,三、体外受精技术,目前，克服早期胚胎发育阻滞主要采用以下三个方法:改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足胚胎发育物质需求，确定并消除对发育不利的因素;利用与体细胞或体细胞条件液共同培养，以提供胚胎发育所需的物质条件。利用临时中间受体,即把体外受精卵放入结扎的中间受体兔或绵羊的输卵管中,培养至桑椹胚或囊胚,再移植到受体或冷冻保存。,三、体外受精技术,体外受精技术的应用前景：通过卵母细胞体外培养成熟和体外受精，可望获得大量体外生产的胚胎;利用体外受精技术，可说不定家畜精子的质量，了解精子受精潜力;通过体外受精程序，可研究无法从体内观察到的配子发育、成熟、获能和受精等一系列受精生物现象，具有重要的科学意义;与其他胚胎工程技术相结合，会加快动物繁殖和育种的进程;在拯救濒危动物和开发珍稀动物方面也具有实际的应用价值。,四、胚胎工程技术 Embryo Bio-engineering,胚胎工程是胚胎移植的延伸技术发展到一定程度而出现的名词，又称为胚胎生物工程（embryo bio-engineering)。这些技术自20世纪80年代以来，赋予了胚胎移植技术以更大的活力与发展潜力。其主要技术有：胚胎及卵母细胞冷冻保存、胚胎分割、性别鉴定、细胞核移植和基因导入等。以下就对其方法做简要介绍:,四、胚胎工程技术,1、胚胎及卵母细胞冷冻保存技术 胚胎及卵母细胞冷冻保存是采取特殊的保护措施和降温程序，使胚胎或卵母细胞在-196的条件下停止代谢，而升温后又不失去代谢恢复能力的一种长期保存胚胎和卵母细胞的技术。对卵母细胞冷冻保存的研究，可分为卵巢卵母细胞和输卵管卵母细胞两个方面。,四、胚胎工程技术,卵母细胞冷冻装管,四、胚胎工程技术,1.1冷冻方法慢速冷冻法：使用渗透性较慢的低温保护剂,一般以低于1/min的速度降温到-30-80,再投入液氮;解冻速度不超过25/min快速冷冻法：这是将胚胎部分脱水后以高于1250/min的速度快速冷冻胚胎的方法。一步细管法：一步细管法就是胚胎解冻后,不需脱除保护剂而直接移植的方法。玻璃化法：1995年Rall开发了玻璃化冷冻法.该法采用约7mol/L的抗冻保护剂，将在0以上的抗冻保护液中平衡后的胚胎直接投入液氮中保存。,四、胚胎工程技术,1.2冷冻保护剂及选择原则冷冻保护剂可分为四类：低分子量可渗透性保护剂：如甘油、乙二醇、二甲基亚砜(SMSO)等。低分子不可渗物质：如海藻糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等。大分子保护剂：如聚乙烯吡咯()、聚乙烯醇()等。混合保护剂:如甘油和乙二醇、甘油和丙二醇、丙二醇和乙二醇、乙二醇和二甲基亚砜()等,再辅以糖类。低温保护剂的选择原则：使胚胎在降温和复温过程中损伤降至最低,解冻后成活率高;便于洗脱,对胚胎无毒或低毒;价廉易得,四、胚胎工程技术,2、胚胎分割技术 胚胎分割(embryo cutting)是80年代发展起来的一种胚胎生物学新技术,它借助于显微外科手术或徒手操作方法,切割早期胚胎(2分,4分)制造同卵多仔后代。迄今为止,该技术已在小鼠、家兔、绵羊,山羊,牛等动物试验成功。1985年德国不莱梅吕凯尔奶牛胚胎移植站切割奶牛胚胎39枚,将其78枚半胚移植受体,44头受体怀孕成功,成功率56.4%,其中有15头孪生犊牛。,四、胚胎工程技术,胚胎分割的方法：胚胎分割的方法有多种,用于致密桑椹胚之后的胚胎方法可归纳为五类:显微玻璃针去带分割法：在显微操作仪下,一臂固定吸住胚胎,另一臂用显微玻璃针摘除透明带并将裸胚对半分割。显微手术刀直接分割法：在显微操作仪下,一臂固定吸住胚胎,另一臂用特制的显微手术刀直接将胚胎分割为二分胚。,四、胚胎工程技术,四、胚胎工程技术,酶消化透明带显微玻璃针分割法：先用含0.5%链酶蛋白酶的Hanks液孵育胚胎,得到裸胚,然后用显微手术刀将其一分为二。酶-机械去带分割法：在用酶软化透明带的基础上,用一支玻璃管除去透明带,然后用显微手术刀将裸胚分割为二。徒手刀片分割法：一般在胚胎分割前,先用0.25%的链酶蛋白酶软化1min,用2%的洗2次,作成0.2ml小滴,使用专用小刀片或自制刀片徒手将胚胎一分为二,或直接切割胚胎为二分胚。,四、胚胎工程技术,3、性别鉴定技术(sexing of embryo)胚胎性别鉴定技术是指依据胚胎中存在的染色体类型、雄性胚胎中X染色体相差酶的活性、雄性胚胎存在的H-Y抗原以及SRY基因等特征对附植前胚进行性别鉴定。,四、胚胎工程技术,目前胚胎性别鉴定主要采用四种研究方法：细胞学方法：主要是通过核型分析对胚胎进行性别鉴定;生物化学方法：通过测定与X染色体相关的酶活性来鉴定雌性胚胎的一种方法;免疫学方法：利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原，从而进行胚胎性别鉴定的一种方法;分子生物学方法：从胚胎取下少量细胞，将其DNA与Y染色体特异标记的DNA序列（探针）杂交，杂交结果如为阳性，则胚胎雄性，反之，则为雌性。,四、胚胎工程技术,细胞核移植技术细胞核移植技术是通过显微操作和细胞融合的方法,将单细胞核供体(卵裂球或体细胞的核)移入去核的胞质受体(卵母细胞或受精卵)中,构成重组胚,再对重组胚进行激活、培养和移植,最后产生1个与核供体亲本基因型相同的后代的过程。,四、胚胎工程技术,细胞核移植技术有两种：McGrath-Solter的一步法：采用磨斜再拉尖的去核吸管，刺透供核卵的透明带，直接吸取细胞核，然后再以同样方法，将核移入去核的受核卵的卵周隙中Tsunoda等的两步法：用微细玻璃针切开供核卵和受核卵透明带的一部分，然后再插入钝圆的吸管，吸出供核卵细胞核，并移入受核卵中。目前在哺乳动物核移植中多采用电融合法，效果较好。,四、胚胎工程技术,细胞核移植技术的方法是：供体核的获得：可以是早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞受体细胞的获得及其去核：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎核卵重组：在显微操作仪操纵下,用一直径接近卵裂球大的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球,注入去核的受体卵母细胞的间隙中,根据移入的部位不同,可分为带下移植和细胞质内注射。,四、胚胎工程技术,融合与激活：将注入卵裂球的去核和电融合液移入电融合槽进行融合重构胚的培养与移植：按各种动物的胚胎培养方法培养与移植。,Courtney L.Riley,Cloning Livestock,History of Nuclear Transfer,1901 Hans Spemann 2 cell embryo=2 tadpoles 1938 Hans Spemann proposed cloning with adult cells 1952 Robert Briggs and Thomas King clone frog,rana pipens,History of Nuclear Transfer,1979 Steen Willadsen embryo splitting to produce sheep and cattle 1981 Karl Illmensee and Peter Hoppe clone mice 1986 Steen Willadensen clones sheep 1987 Randy Prather clones cattle Limitations:Limited numbers possible and clones are unproven,History of Nuclear Transfer,Somatic cell cloning with adult cells,1997,Dolly with Ian Wilmut,History of Nuclear Transfer,Wakayama et al.1998,Shin et al.2002,Meng et al.1997,Baguisi et al.1999,Polejaeva et al.2000,Chesne et al.2002,Nuclear Transfer,Enucleation of donor oocyteTransfer somatic cell from animal to be cloned to enucleated oocyteFusion of somatic cell to cytoplasm via electrical pulseActivation of oocyte somatic cell complex Culture embryo to blastocyst stage then transfer to synchronized recipient,Nuclear Transfer,Traditional Method,The Piezo Method is an alternative.It requires lysis of the donor cell then recovery of nucleus for transfer to enucleated oocyte.,Why Clone?,Produce Sets of Genetically Superior AnimalsDesired Sex Disease resistance Improved Production Ease of Management Improved ProfitsUniformity of Crop and Improved Herd Management Nutrition Health Reproduction Marketing,Genetically Engineered Livestock,Disease Resistance and Heat Tolerance,High Nutritional Efficiency,Milk production High level of production Milk produced has better chemical characteristics Improving the digestibility and nutritional properties Production of oral vaccines and biopharmaceuticals,Xenotransplants andDisease Models,Modification of Muscle Mass,High Reproductive Capacity,KNOCK OUT-Disrupt gene function KNOCK IN-Replace gene with another,Gene Targeting,EES cell S cell,Targeting Vector,Cell with one targeted locus,Selection,Creating Genetic Modifications,Electroporation,Dr.Karen Moore Using the lab micromanipulator,MicromanipulatorUsed for enucleation and cloning,Challenges in Cloning,Inefficiencies in nuclear transfer embryo productionFusion 60-90%Embryo development 20%Early embryonic and fetal lossLarge Offspring Syndrome and Dystocia,Large Offspring Syndrome,Extended gestationEnlarged birth weight(8-50%)Dystocia resulting in Caesarian sectionHigh prenatal lossPostnatal weaknessHypoxia,hypothermia,hypoglycemiaHigh plasma insulin(up to 4 times higher than normal)Increased muscle mass,oversized organs,skeletal malformationsPlacental abnormalities,Large Offspring Syndrome,Normal Bovine Placenta,Abnormal Bovine Placenta,Aborted Clone,Large Offspring Syndrome,Possible Causes includeIn vitro culture systemsAsynchronous transferIncreased maternal progesterone levels during first six days of pregnancyImprinted genes,Beckwith-Wiedemann Syndrome,Large newborn Large,protruding tongue and prominent eyes Pinna abnormalities and low set earsAbdominal wall defect:umbilical hernia or omphaloceleLow blood sugar or hypoglycemiaEnlargement of some organs and tissues,Prader-Willi Syndrome,Skeletal and limb abnormalitiesSmall size for gestational ageAlmond-shaped eyes and narrow bifrontal skull Small hands and feet compared to bodySlow mental development Growing child exhibits slow mental and increasing obesity,Gene Imprinting,Epigenetic regulation of gene expressionGenes in which expression is dependent upon parent of origin Play key roles in fetal growth and developmentIGF-2 and its receptor are both imprinted genes that impact fetal developmentFetal overgrowth is associated with over expression of IGF-II,Imprinting Mechanisms,Methylation can silence genes by:inducing DNA folding=heterochromatininhibiting transcription factor binding or recruitment of other proteins which inhibit transcription factor bindingInactive allele is replicated later in the cell cycle,Imprinting,IGF-2 paternally expressedH19 maternally expressedImprinted allele is silenced,Conclusion,Future uses of cloning will include the use of transgenesis and gene targeting to improve production traits in cattleCurrent research around the world should improve cloning efficiencies to make this technology economically feasible to all cattlemen,Animal Cloning,Melissa Schultz And Sally Dean,Dolly,In 1997,first viable offspring derived from differentiatedcells of an adult.This was achieved by nuclear transfer Dolly was genetically identical to the donor ewe.,How is it Done?,So:Science Explained,Gene the cloned calfAugust 1997,Used primordial stem cells from 30-day old calf fetusHow is this different than Dolly?Possibilities of using cloned cattle to improve meat anddairy quality,Cc:,The first successful companion animal clone-paving the way for commercial pet cloningCloned in the same way as Dolly but instead using cumulus and fibroblast cells of an adult female donorCoat color not exactly like donor but genetic material is,Commercial Pet Cloning,Genetic Savings and Clone-company advertising cloning of pets-Price list for skin sample storage:$895 for standard service and$1395 foremergency serviceTexas A&M-estimated cost of$250,000 for a pet clone,Missyplicity Project,GSC along with Missys wealthy owners are funding this projectSame researchers that cloned Cc are working on this projectIf successful,this will be the first dog cloneDog cloning will be more difficult than cat.,Why Clone?,FOOD ANIMALS(Ruminants)Increase quality and consistency of milk and meat productsHuman pharmaceutical interest-transgenic animals yield human proteins,Why Clone?,FOOD ANIMALS(Pigs)Potential for being a hot commodityXenotransplantation into human recipients-Transgenic pig organs will hopefully have less of an effect on the human immune system.Parkinsons Disease,Why Clone?,CatsResearch Human AIDS using the feline AIDS(FIV)as a model.PoultryCurrently developing a method to clone poultry eggs,Why Clone?,Goats-Spider Silk ProteinRabbits-Valuable for studying human cardiovascular disease,Why Clone?,Primates(Non-Human)Not a practice run for human cloningGoal is to create identical animals to study human diseases(ex.Hepatitis),Why 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