分离生物活性肽的膜工艺设备.ppt

分离生物活性肽的膜处理工艺和设备,专业：化学工艺姓名：朱道学,第一部分,生物活性肽,主要内容,1.1 生物活性肽研究简史1.2 生物活性肽定义、功能、特性、作用1.3 生物活性肽的分类1.4 重要活性肽研究简介1.5 生物活性肽的作用机理1.6 生物活性肽生产方法1.7 生物活性肽产品,1.1 生物活性肽研究简史,1902年伦敦大学医学院的两位生理学家Bayliss和Starling在动物胃肠里发现了一种能刺激胰液分泌的神奇物质。他们把它称为胰泌素。这是人类第一次发现的多肽物质。1931年一种命名为P物质的多肽被发现，它能兴奋平滑肌并能舒张血管而降低血压。科学家们从此开始关注多肽类物质对神经系统的影响，并把这类物质称为神经肽。1953年由Vigneand领导的生化小组第一次完成了生物活性肽催产素的合成。50年代末Merrifield发明了多肽固相合成法并因此荣获诺贝尔化学奖。60年代初期多肽的研究出现了惊人的发展，多肽的结构分析、生物功能等都相继取得成果。1965年我国科学家完成了牛结晶胰岛素的合成，这是世界上第一次人工合成多肽类生物活性物质。,70年代神经肽的研究进入高潮，脑啡肽及阿片样肽相继发现，进入了多肽影响生物胚胎发育的研究。1975年Hughes和Kosterlitz从人和动物的神经组织中分离出内源性肽，丰富了生物制药内容，开拓了“细胞生长调节因子”这一生物制药的新领域。80年代多肽研究逐渐发展为独立的专业，它包含了生命科学最新的分子生物学、生物合成、免疫化学、神经生理、临床医学等多个学科。90年代人类基因组计划启动。随着科学家们解密一个个基因，多肽研究及其应用出现了空前繁荣的局面。迄今为止，多肽的研究已经取得了惊人的成果。人们发现，存在于生物体的多肽有数万种之多，所有的细胞都能合成多肽，几乎所有的细胞都受多肽的调节。,1.2 生物活性肽定义 定义1：生物活性肽是蛋白质中25个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。定义2：生物活性肽指的是一类分子量小于6000D，具有多种生物学功能的多肽。其分子结构程度不一，可从简单的二肽到环形大分子多肽，而且这些多肽可通过磷酸化、糖基化或酰基化而被修饰。功能 活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。特性 它有良好的吸收性，它的吸收效率比氨基酸和蛋白质都高。它有独特的生理调节功能，胰岛素调节血糖就是一个例子。肽的活性很高，往往很小的量就能起到很大的作用。,作用 人体肽物质来源于蛋白质营养，主要是两个方面，一是食物在消化过程中蛋白质产生肽，被身体吸收；二是体内细胞利用蛋白质的降解物氨基酸直接合成。如果由于营养、消化、疾病等原因，体内肽物质的缺乏，将会使人体的健康受到影响，例如：免疫能力降低、消化不良、代谢异常、生长发育障碍等等。进而使健康人产生疾病，使病人难以康复。科学家已在人体中发现了100多种生物活性肽，这些肽具有传递生理信息，调节生理功能的作用，对于人体的神经、消化、生殖、生长、运动、代谢、循环等系统的正常生理活动的维持非常重要，所有疾病的发生、发展、治疗、康复都与肽有关系。因此，科学家建议，针对身体需求，在满足了人体的基本营养摄入后，适当补充肽营养，对于健康和疾病康复是大有好处的。,1.3 生物活性肽的分类,1.4 重要活性肽研究简介乳肽 早在20世纪50年代，某公司即以乳酪蛋白酶解制取了第一代的酪蛋白肽和氨基酸混合物，含58个氨基酸组成的肽和70以上的游离氨基酸，用于低抗原性防过敏牛奶粉，在市场上行销40多年；6070年代，开发出第二代的高度水解乳清蛋白肽混合物，含1012个氨基酸组成的肽和4060的游离氨基酸。以上两代产品的游离氨基酸含量过高，影响了产品的风味和生物效价；90年代，推出了低度水解乳清蛋白肽混合物，含1015个氨基酸组成的肽和20以下的游离氨基酸，产品风味明显改善，生物效价提高。1992年，和Mozffar.Z研究了胰蛋白酶、凝乳蛋白酶等酶的固定化反应器制取乳肽的工艺，可以通过调节流速来控制反应程度，并通过重复使用酶来降低成本。1989年，.和Ieonil.j.研究了带超滤膜的酶反应器，在反应器内加入钙和磷酸根离子，用于制备酪蛋白磷酸肽和去磷酸化酪蛋白多肽。,我国对乳肽的研究不多，主要是进行蛋白酶的筛选和酶解工艺的优化，如1991年，肖安乐等人筛选出胰蛋白酶的胰酶是水解变性乳清蛋白质的最佳酶种；1994年，王凤翼等人对胰蛋白酶控制水解酪蛋白的最佳条件进行了优选；张和平等人采用胰蛋白酶水解热敏性乳清蛋白，获得热稳定好、易溶解的多肽，并以此开发出稳定性良好的乳清饮料；1995年，于江虹也从牛乳酪蛋白中分离提纯获得酪蛋白磷酸肽，证实了其在小肠中可与钙、铁等矿物质形成可溶性络合物，促进人体对钙、铁的吸收；广州市轻工研究所生产的酪蛋白磷酸肽CPP含量达85以上，易溶于水，加工性能稳定，已在我国市场上推出。最近，我国生物工作者开发了采用微生物发酵控制、蛋白转化率高的乳肽产品，其中氨态氮占20左右、肽态氮占80左右，产品无不良气味，已获专利；湖北工学院吴思方等人进行了固定化胰蛋白酶生产酪蛋白磷酸肽的研究，CPP得率为21.3，产品中CPP总含量为15，此工艺中酶可重复多次使用，既降低了成本，又有利于产品分离和生产自动化。,大豆肽 大豆肽是大豆蛋白质经酸法或酶法水解后分离、精制而得到的多肽混合物，以36个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量大分子肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分，分子质量在1000以下。大豆肽的蛋白质含量为85左右，其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，必需氨基酸的平衡良好，含量丰富。大豆肽与大豆蛋白相比，具有消化吸收率高、提供能量迅速、降低胆固醇、降血压和促进脂肪代谢的生理功能以及无豆腥味、无蛋白变性、酸性不沉淀、加热不凝固、易溶于水、流动性好等良好的加工性能，是优良的保健食品素材。大豆肽的生产有酸法水解和酶法水解。酸法因水解程度不易控制、生产条件苛刻、氨基酸受到损害而很少采用；酶法水解易控制、条件温和、不损害氨基酸而大多被采用。酶的选择至关重要。通常选用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，也可选用木瓜和菠萝等植物蛋白酶。但应用较广的主要是放线菌166、枯草芽孢杆菌1389、栖土曲霉3942、黑曲霉3350和地衣型芽杆菌2709等微生物蛋白酶。,20世纪70年代初，美国首先研制出大豆肽，D.S公司建成了年产5000吨食用大豆肽装置；日本于80年代开始研制大豆肽，不二制油公司首先采用酶法规模化生产出3种大豆肽，雪印和森永等乳业公司应用大豆肽生产食品。我国近几年也开展了大豆肽的生产和应用研究。江西省科学院高科技中心李雄辉等人采用ASI389中性蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶水解生产大豆肽，使大豆肽生成率为62.9，肽态氮含量大于85，游离氨基酸含量小于8，平均肽键长度58，分子质量2000左右。双酶水解工艺既缩短了酶解时间、提高了蛋白质水解度，又减轻了产品苦味。华南理工大学黄惠华等人用木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白进行水解试验，测得木瓜蛋白酶的动力学常数。另外，无锡轻工大学的葛文光对大豆肽的生理功能及作用效果进行了研究；郭敏亮采用豆粕生产出大豆肽饮料等。根据大豆肽的理化特性，可用大豆肽为基本素材，开发肠胃功能不良者和消化道手术病人康复的肠道营养食品的流态食品、降胆固醇、降血压、预防心血管疾病的保健食品，增强肌肉和消除疲劳的运动员食品、婴幼儿及老年人保健食品、促进脂肪代谢的减肥食品、酸性蛋白饮料和用作促进微生物生长、代谢的发酵促进剂等。,高F值寡肽 高F值寡肽即是由动、植物蛋白酶解后制得的具有高支链、低芳香族氨基酸组成的寡肽，以低苯丙氨酸寡肽为代表，具有独特的生理功能。F值是指支链氨基酸（BCAA）与芳香族氨基酸（AAA）的摩尔比值。1976年，Yamashita等人首次利用胃蛋白酶和链霉蛋白酶从鱼蛋白和大豆分离蛋白酶解中制得含低苯丙氨酸的寡肽混合物，产率分别为69.3和60.9，苯丙氨酸含量分别为0.05和0.23。1982年，Nakhost等人用胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A酶解大豆蛋白，也制得相似的产物。1986年，Soichi等人进行了多种酶分别酶解乳清蛋白制取低苯丙氨酸寡肽的多种工艺、方法试验，结果以胃蛋白酶链霉蛋白酶两步水解法为佳，产品得率为81.0、苯丙氨酸含量为0.30。1991年，Shinya等人用嗜碱蛋白酶和肌动蛋白酶水解玉米醇溶蛋白，制取了无苦味高F值寡肽，产率为56.0，F值20.00，AAA含量为1.86。,1996年，西班牙的Bautista等人用肌动蛋白酶和Kerase中性蛋白酶酶解葵花浓缩蛋白，制取高F值寡肽，产率为24.8，F值为20.47，AAA含量为1.01。王梅也在1992年首次采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶降解玉米黄粉；成功地研制出高F值寡肽混合物，产率为7.9，F值为31.00，AAA含量为0.06，完全符合高F值制剂的要求，为解决玉米湿法淀粉厂副产品黄粉的综合利用开创了新路子。高F值寡肽具有消除或减轻肝性脑病症状、改善肝功能和改善多种病人蛋白质营养失常状态及抗疲劳等功能，除可制作治疗肝疾药品外，还可广泛用作保肝、护肝功能食品，烧伤、外科手术、脓毒血症等高付出病人及消化酶缺乏患者的蛋白营养食品和肠道营养剂，高强度劳动者和运动员食品营养强化剂等。,谷胱甘肽（GSH）谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的活性三肽，广泛存在于动物肝脏、血液、酵母和小麦胚芽中，各种蔬菜等植物组织中也有少量分布。谷胱甘肽具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子。日本在50年代开始研制并应用于食品，现已在食品加工领域得到广泛应用。我国对谷胱甘肽的研究尚处于起步阶段。谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、微生物发酵法和酶合成法等4种，其中利用微生物细胞或酶生物合成谷胱甘肽极具发展潜力，目前即以酵母发酵法生产为主。,由于谷胱甘肽分子有一个特异的肽键，决定了它在人机体中的许多重要生理功能，如蛋白质和核糖核酸的合成、氧及营养物质的运输、内源酶的活力、代谢和细胞保护、参与体内三羧酸循环及糖代谢，具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、清除体内过多自由基、解毒护肝、预防糖尿病和癌症等功效，因此而成为机体防御功能肽的代表。谷胱甘肽除可在临床上用作治疗眼角膜疾病，解除丙烯酯、氟化物、重金属、一氧化碳、有机溶剂等中毒症状的解毒药物外，还可用于运动营养食品和功能食品添加剂等。,1.5 作用机理,谷胱甘肽（Glutathione，简称GSH）,谷胱甘肽（GSH）清除自由基的作用机理,GSH中有1个活泼的琉基-SH，易被氧化脱分子的GSH失氢后转变为氧化型的谷胱甘肽（GSSG），但在生物体中起着重要作用的是还原型的GSH,谷胱甘肽结合反应,谷胱甘肽-S-转移酶能催化还愿型谷胱甘肽（GSH）与一些卤化有机物、环氧化等结合，降低环氧化物的毒性，对基体起保护作用。,抗菌多肽(Antimicrobial peptides）,抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子肽，可分为环状肽、唐肽和脂肽3类。在动植物防御病原微生物的感染中起到重要的防御作用。,抗菌肽的抗菌作用机理,首先结合在质膜上。接着其分子中的疏水段和两亲性a-螺旋也插入到质膜中。最终通过膜内分子间的相互位移，抗菌肽分子聚集形成离子性通道，使细胞失去膜势而死亡。,抗菌多肽的优点,不产生耐药性杀菌速度快对人体无毒副作用,价值,1.小肽吸收快速、低耗、不易饱和为某些特殊身体状况的人群补充营养对乳酸菌、双歧杆菌和酵母菌等多种微生物的生长有促进作用。低抗原性，渗透压比氨基酸低。,2.免疫活性肽,人乳或牛乳中的酪蛋白含有刺激免疫的生物活性肽，大豆蛋白和大米蛋白通过酶促反应，可产生具有免疫活性的肽，很多肽都具有免疫活性。有些肽除了具有刺激巨噬细胞的吞噬能力外，还能抑制肿瘤细胞的生长。,3.神经活性肽,多种食物蛋白经酶解后，会产生类鸦片活性肽（如脑啡肽、生长激素抑制剂、舒缓激肽和促甲状腺释放激素）TLH等神经活性肽，可起到镇痛及调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温的作用。,4.降压血肽,许多蛋白质的酶解产物中都有血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）。血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂（ACEI，即降血压肽）通过抑制ACE的活性来实现降压功能的，达到治疗高血压的目的。,5.其他活性肽,其他功能的活性肽：降胆固醇肽、促进矿物质吸收的肽（CPPS）、酶调节剂（如促胰酶肽）、激素肽如生长激素释放因子（GRFS）、白蛋白胰岛素增效肽、抗菌多肽（如乳酸链球菌素、橡胶素）、抗癌多肽（如肿瘤细胞坏死因子、环已肽）、抗艾滋病肽（如GLQ蛋白）等。食品感官肽：甜味肽（如赖氨酸二肽）、苦味肽（如咖啡肽）以及酸味肽、咸味肽、风味肽、抗氧化肽、表面活性肽等。,1.6 生物活性肽的生产方法,天然活性肽的分离提取 存在于细菌、真菌、动植物等生物体内的激素、酶抑制剂等天然活性肽，经分离提取而得。食品蛋白质水解制取活性肽 一般采用酸水解，工艺简单、成本低，但因氨基酸受损严重、水解难控制而较少应用。化学合成多肽 采用液相或固相化学合成法可制取任意需要的活性肽，但因成本高、副反应物及残留化合物多等因素而制约其发展。基因重组法制取多肽 采用DNA重组技术制取活性肽的试验研究尚在进行中。酶法生产活性肽 产品安全性极高，生产条件温和，水解易控制，可定位生产特定的肽，成本低，已成为最主要的生产方法。酶法生产活性肽工艺一般流程为：选择原料蛋白预处理酶解精制成品,1.7 生物活性肽产品,保健品和药物，如武汉九生唐生物工程有限公司生产的三九蛋白肽、”三九牌大豆多肽”、“九生牌降糖肽”、“三九牌调脂康口服液（降脂肽）”、“三九牌长线条口服液（减肥肽）”、“九生牌抗癌肽”、“九生牌抗艾滋病毒肽”等。,第二部分,精制生物活性肽的膜处理工艺和设备,主要内容,1 压力驱动工艺 1.1 膜基本知识 1.2 超滤 1.3 纳滤2 加外电场的膜驱动工艺 2.1 电增强型膜过滤 2.2 强制流膜电泳 3 电泳的膜工艺 3.1 电泳 3.2 固定边界电泳分离 3.2.1 基本原理 3.2.2 Gradiflow 技术 3.3 电渗析 3.3.1 基本原理 3.3.2 膜过滤电渗析法 4 未来发展趋势,1 压力驱动膜过程简介,微滤是指大于0.1m的颗粒或可溶物被截留的压力驱动模型过程；超滤是指小于0.1 m大于2nm的颗粒或可溶物被截留的压力驱动模型过程；反渗透是指高压下溶剂逆着其渗透压而选择性透过的膜过程；纳滤是指小于2nm的颗粒或可溶物被截留的压力驱动模型过程。,1.1 膜基本知识,膜技术发展简介,膜广泛地存在于自然界，与生命起源和生命活动紧密相关在许多自然现象中发挥重大作用，在现代化的经济发展和人民日常生活中也扮演重要角色对膜的认识和开发仅有二百多年的历史膜科学和技术的飞跃发展是近三十年的事，倍受科技界和工业界的重视,膜技术发展简介（续）,膜技术特点（1）,无试剂加入，无额外材料损耗，无需再生，无二次污染，可连续操作能充分利用工业压力源做为膜分离推动力，物料仅通过简单流经膜表面即可得到分离 工艺相容性强，易与相关工艺配套，能因地制宜地满足多样化工艺组合要求,膜技术特点（2）,模块组合方式既可满足集中应用，又可进行单元操作，不受场地和自然环境的限制 常温操作，投资少、能耗低、回收率高，无公害 设备结构紧凑，占据空间小；工艺简单，组装方便；易操作，免维护 一般无需相变和化学变化即可达到分离目的,m,A,RELATIVE,SIZE OF,COMMON,MATERIAL过滤对象,MOLECULAR,WEIGHT分子量,0.001,10,0.01,100,0.1,1000,1.0,10,4,10,10,5,100,1000,10,6,10,7,100,200,5,000,20,000,150,000,500,000,Aqueous salts中水盐份,Metal ions金属离子,Sugars蔗糖,FILTRATION,TECHNO-,LOGY过滤方法,Pyrogens热源,Virus病毒,Colloidal silica胶体硅,Albumin protein白蛋白,Bacteria细菌,Carbon black碳黑,Paint pigment颜料色素,Yeast cells酵母,Milled flour面粉,Beach sand海滩沙砾,Pollens花粉,RO反渗透,Ultrafiltration 超滤,Microfiltration微滤,Particle filtration一般过滤,THE FILTRATION SPECTRUM 过滤谱图,NF 纳滤,压力驱动膜截留溶质分子大小比较,水,各种膜的分离特性,乳制品分离谱图,1.2 超滤,原理：超滤同微滤类似，也是利用膜的“筛分”作用进行分离的膜过程。在静压差的作用下，小于膜孔的粒子通过膜，大于膜孔的粒子则被阻拦在膜的表面上，使大小不同的粒子得以分离，不过其过滤精度更高，因而膜孔更小，实际的操作压力也比微滤略高，一般为。对象：超滤主要用于从液相物质中分离大分子化合物(蛋白质，核酸聚合物，淀粉，天然胶，酶等）、胶体分散液（黏土，颜料，矿料，乳液粒子，微生物）以及乳液（润滑剂，洗涤剂，油水乳液)。采用先与适合的大分子结合的方法也可以从水溶液中分离金属离子、可溶型溶质和高分子物质（如蛋白质、酶、病毒），以达到净化、浓缩的目的。,1.2 超滤,超滤膜一般为非对称膜，由一层极薄（通常为0.11um）具有一定孔径的表皮层和一层较厚（通常为125um）具有海绵状或指状结构的多孔层组成，前者起筛分作用，后者起支撑作用。分离机理：一般认为超滤过程的分离机理为筛孔分离过程，但膜表面的化学性质也是影响超滤分离的重要因素，即超滤过程中溶质的截留包括在膜表面上的机械截留（筛分）、在膜孔中的停留（阻塞）、在膜孔表面及膜孔内的吸附三种方式。,1.2 超滤,超滤的操作模式和微滤类似，基本上是死端过滤和错流过滤两种，但由于超滤的功能与微滤有所不同，微滤多数是除杂，产物是过滤液；而超滤着重是分离，产物既可以是渗透液，也可以使截留液或者二者兼有，因此在这两种基本模式的基础上又发展了多种模式。,中空纤维超滤膜结构,单 内 皮 层,双 皮 层,Hollow-fiber membrane,Cross section,Surface,mm,Cross section,MF、UF主要公司,国外：Millipore、Pall、Sartorius、Gelman、Koch、Cuno、Zenon、富士、三井、三菱等国内：折叠微孔膜、中空纤维膜组器生产厂家较多 杭州北斗星膜制品有限公司：卷式UF、MF膜组器,MF、UF发展方向,无机膜浸没式MF或UF组器MF或UF+活性炭生产饮用水连续膜过滤（中空UF、MF）高度不对称膜高孔隙率、大孔径热致相分离MF膜新应用领域开发,1.3 纳滤,纳滤（Nanofiltration）是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右。与其他压力驱动型膜分离过程相比，出现较晚。它的出现可追溯到70年代末的NS-300膜的研究，之后，纳滤膜大多从反渗透膜衍化而来，但与反渗透相比，其操作压力更低，因此纳滤膜又称作“低压反渗透”或“疏松反渗透”。与超滤或反渗透相比，纳滤过程对单价离子和分子量低于200的有机物截留较差，而对二价或多价离子及分子量介于200500之间的有机物有较高的脱除率，基于这一特性，纳滤过程主要应用于水的软化、净化以及相对分子量在百级的物质的分离、分离和浓缩（如染料、抗生素、多肽、多糖等化工和生物工程产物的分级和浓缩）、脱色和去味等。,纳滤,纳滤膜分离性能范围,纳滤分离原理,与超滤膜相比，纳滤膜有一定的荷电容量，对不同价态的离子存在Donnan效应；与反渗透膜相比，纳滤膜又不是完全无孔的，因此其分离机理在存在共性的同时，也存在差别。其对大分子的分离机理与超滤相似，但对无机盐的分离行为不仅由化学势梯度控制（溶解扩散原理），也受电势梯度的影响，即纳滤膜的分离行为与其荷电特性、溶质荷电状态以及二者的相互作用均有关系，在现存的文献报导中，关于纳滤膜的分离机理模型有空间位阻-孔道模型、溶解扩散模型、空间电荷模型、固定电荷模型、静电排斥和立体位阻模型、Donnan平衡模型等。,纳滤分离规律,对于阴离子，截留率递增的顺序为：NO3-、Cl-、OH-、SO42-、CO32-；对于阳离子，截留率递增的顺序为：H+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、等；截留分子量在200-1000之间，分子大小为1nm的溶解组分的分离。,纳滤,分离机理：筛分、优先吸附、离子作用分离范围：介于RO、UF之间膜种类：芳香聚酰胺复合膜、CA-CTA不 对称膜、磺化聚电解质复合膜膜组器：卷式、管式应用：膜软化、水净化、染料、多糖、抗菌素纯化浓缩,2 加外电场的膜驱动工艺,电增强型膜过滤（Electrically-Enhanced Membrane Filtration）强制流膜电泳（Forced-flow Membrane Electrophoresis）,2.1 电增强型膜过滤,电增强型膜过滤相对于传统膜过滤单元添加了一个外电场，因此，膜的选择性与生物分子的电泳淌度和膜的筛分性有关。为了适应电势梯度，报导了两种不同电滤尘器的膜构型。,两种不同电滤膜构型,电极平行放置的过滤膜,电场加在膜和另一个电极之间,电增强型膜过滤的优缺点,优势：有效地减少了膜污染和提高了膜的选择性。缺点：压力梯度模块产生的微粒累积在膜表面附近，从而改变了膜的选择性；在这种构型中，由于电极反应动力学的影响，电极隔间没有把已处理的溶液和渗透过来的溶液分开；电极附近的PH值改变了。,2.2 强制流膜电泳,强制流膜电泳首先用于分离带电大分子化合物的悬浮液，如在平行膜之间的蛋白质。大分子化合物根据它们的电荷转移。电场方向垂直于膜，与溶液流出方向平行。由于极性不同，一部分蛋白质保留在膜的一侧，而目标蛋白质则透过膜，这样就使蛋白质变得更纯了。,强制流膜电泳,为了改进强制流膜电泳Perry对其进行了改进。分离是在电泳槽中进行的。,Feed recirculation（原料循环）Permeate（渗透）AEM（anion exchange membrane 阴离子交换膜）CEM（cation exchange membrane 阳离子交换膜）Electrolyte（电解液）,强制流膜电泳的原理图解,强制流膜电泳进一步改进,Cathodic buffer（阴极缓冲液）Anodic（阳极缓冲液）,改进后强制流膜电泳的原理图解,强制流膜电泳,强制流膜电泳技术是用来分离混合蛋白质的，尽管如此，但是它从来没用于测试多肽碎片。通过增加膜面积可以放大强制流膜电泳。然而，它需要高电压（100V/cm）和较低的流动速率等因素限制了它的工业化。,3 电泳的膜工艺,3.1 电泳定义电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresis technique）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister）。电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。,目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等。,电泳的简单原理,蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。,物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场 中它们的移动方向和移 动速度也不同，因此可 使它们分离。,电泳现象和电渗流现象,（一）醋酸纤维素薄膜电泳 电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品 用量少。因此特别 适合于病理情况下 微量异常蛋白的检测。,血清蛋白的电泳图谱,电泳技术介绍,应用实例,白蛋白、蛋白素、蛋白质球蛋白球蛋白球蛋白电泳法分离血清蛋白,血清蛋白电泳 新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后，通常可见5条带，即清蛋白、1、2、和球蛋白。许多疾病总血清蛋白浓度和各蛋白组分的比例有所改变，通过血清蛋白电泳图谱能帮助我们对某些疾病进行诊断及鉴别诊断。,血清蛋白电泳图谱,（二）凝胶电泳 由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。它具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗 作用、设备简单、样品量小(1100g）、分辨率高等优点。,凝胶电泳图,（三）等电聚焦电泳 1 等电聚焦电泳过程 一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。,净电荷与PH的关系曲线,2等电聚焦电泳的特点 使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快;分辨率高;加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电点;适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。,电泳弊端及改进技术,与待观察和分析的比例相比，溶解性较差。电泳产率达到某种程度后就不可能再增加了，典型的产率是每小时几毫克。,为了克服这些弊端，提出了2种不同的技术，固定边界电泳和电渗析。这些区域有多个小区域，每个小区域用膜隔开。膜有2个显著的特点：选择性由溶质流过膜的速率决定；增加小隔间的个数，产率会增加，但是不影响膜的选择性。,3.2 固定边界电泳分离,3.2.1 基本原理在固定边界电泳分离中，半渗透膜将流体分为两股，一股为带电分子流体，另一股为下游流体（如图）。流体在电极间流动，料液中的带电分子在高达（380V/cm）的电压下穿过膜。缓冲液在电泳分离过程中通过在电极隔间循环流动控制PH的变化。,固定边界电泳原理图解,3.2.2 Gradiflow技术,Gadiflow 仪是根据介体电泳技术（preparative electrophorestsis）原理发明的。介体电泳技术是生物纯化技术的一个革命，它将电泳分离技术的原理与膜过滤分离技术的原理的相结合，利用分子的大小和其所带电荷的性质不同，对复杂的生物溶液进行纯化、浓缩和盐析。澳大利亚著名科学家 Joel Margolis,即第一块梯度电泳胶的构思者，根据介体电泳技术原理发明了Gradiflow仪，经过10多年的研制和改进后，于 1998年开始进入市场，相对于超滤和往层析等常用分离技术，因为其纯化条件温和、无需加压和特殊处理，因此能够快速、高质量和低成本地分离纯化生物活性物质。,介体电泳技术的优越性,减少了生物活性物质的降解，纯化条件温和，无强酸强碱、强电解质溶液，无高压，可在适宜的温度下操作；纯化费用低，操作容易，Gradiflow仪无需柱子、电泳胶，无需高压、梯度处理和冷冻室，且仪器设备的价格低廉；产量高，纯化时间短，纯化速度可达80gh；纯化的同时可进行浓缩和脱盐，所以适用于未经加工的原溶液；因每次更换新的分离膜片，无交叉污染；Gradiflow仪在纯化的同时可以除去病毒、细菌和内毒素等病原体。,介体电泳技术的原理与仪器构造,介体电泳技术利用物质分子量的大小和其所带电荷的性质不同，将所需要的物质与杂质分开。其主要部件是一个分离膜片，分离膜片由三层聚丙烯酸肢膜组成，上下两层是小孔径的限制膜，它们只允许相对分子质量小于3103的小分子或离子通过，中间一层是分离膜，它的孔径可根据分离的需要选择，但通常比限制膜的孔径大，且孔径大小一致。操作时，将分离膜片插入分离装置中，在分离膜片的上下是两个电极，在电极与分离膜片之间循环已冷却的缓冲液，目的是调节被分离溶液的PH值，和冷却因电场产生的热量，以保证整个分离过程在所需的温度和PH值下进行。,需要分离的溶液在限制膜与分离膜之间通过泵形成两个循环，其中分离膜上部的循环液叫上流（Upstream），下部的循环液叫下流（Downstream），通常需要分离的溶液循环在上流，而空白液循环在下流。当开启电源后，带有不同电荷的物质将向两个不同的电极方向运动，而分离膜只允许分子量小于其孔径的分子通过。根据所需要物质的分子量大小和等电点，选择分离膜孔径的大小和缓冲液的 pH值，可将需要的物质与各种杂质分开在上流和下流溶液中。Cradiflow仪与紫外分光光度计连接，可监测上流和下流中所需要物质浓度的变化。,介体电泳技术应用,采用介体电脉技术分离纯化的物质,3.3 电渗析（Electrodialysis）,3.3.1 电渗析（ED）发展概况3.3.2 电渗析基本原理3.3.2 膜过滤电渗析法,3.3.1 电渗析（ED）技术的发展概况,对电渗析的基本概念的研究是从19世纪50年代开始的。1854年 Graham发现了渗析现象；1862年 Dubrunfant制成了第一个膜渗析器，并成功地进行了糖与盐的分离；1940年 Meyer和Strauss提出了具有实用意义的多隔室电渗析装置的概念；1950年 Juda试制成功了第一张具有选择透过性的阳、阴离子交换膜，奠定了ED技术的实用基础，ED技术得到迅速发展。1952年 美国Ionics公司制成了第一台电渗析装置；19541956年 英、美将ED首先应用于生产实践中，主要应用于苦咸水淡化、制备工业用水和饮用水，此后，ED 技术逐步被引入北非、南非以及中东地区。,1959年 前苏联开始研究和推广应用ED技术；1966年 美国Du Pont公司研制全氟磺酸离子交换膜；1970年 日本将电渗析器用于苦咸水淡化；1972年 美国Ionics公司推出频繁倒极电渗析(EDR)装置；1974年 日本在野岛建造了日产饮用水120t的海水淡化ED装置；1982年 日本成功开发了全氟阴离子交换膜（AEM）；1991年 我国研制成功了无极水全自动控制ED器，以城市自来水为进水，单台多级多段配置，脱盐率为99%以上，原水利用率达70%以上。20世纪80年代中后期，常规ED技术在国外的发展进入了萎缩阶段，西欧已基本不用。,我国电渗析技术的发展概况,1958年 开始电渗析技术的研究；1960年代初 小型ED装置投入海上试验；1965年 在成昆铁路上安装了第一台苦咸水淡化装置；1966年 开始工业化试生产聚乙烯异相离子交换膜，从此ED技术开始进入实用化阶段；1967年 异相离子交换膜投入生产，为电渗析技术的推广应用创造了条件；1970年代以来 ED技术发展较快，离子交换膜生产已具相当规模，全国共有44个膜品种，已商品化的有12类19种，并已具有相当高的水平。我国离子交换膜产量占世界第二。,3.3 电渗析（Electrodialysis）,3.3.2 电渗析基本原理电渗析指在直流电场作用下，溶液中的荷电离子选择性地定向迁移，透过离子交换膜并得以去除的一种膜分离技术。采用电渗析过程脱除溶液中的离子，基于2个基本条件：1）离子交换膜的选择透过性；2）直流电场。,离子交换膜（ion exchange membrane）是电渗析器的主要部件，有“电渗析的心脏”之称。它是一种由高分子材料制成的具有离子交换基团的薄膜。在这里，离子交换膜的作用并不是起离子交换的作用，而是起着离子选择透过的作用，所以更确切地说应称之为“离子选择性透过膜”。,离子交换膜的组成,离子交换膜,膜的主体,增强材料(保证膜的强度和尺寸稳定性),活动部分,膜解离机理,电渗析原理,3.3.3 膜过滤的电渗析法（Electrodialysis with Filtration Membranes）EDFM/EDUM,电渗析过程示意图,电渗析过程原理图,阳极反应：阴极反应：,电渗析运行时可能发生的过程,用超滤膜部分代替离子交换膜（EDUM）,超滤膜电渗析法（EDUM）主要是依据生物活性肽所带电荷和截留分子量大小（MWCO）进行分离。只有带电荷的分子在电场作用下移动，而中性分子在理论上待在原料进口处也不穿过膜。EDFM只需低压就可进行操作，因此用于处理工艺的模块就是实现工业化所需的电渗析槽，高压可能会损坏过滤膜，高电压产生的高能量还可能破坏氨基酸结构；该技术还可以用于大规模处理。然而，在用同一种工艺分离两种或多种化合物，限制了电渗析槽的设计。事实上，供工业用的电渗析槽只配置了4股流体流通还包括电解液。,EDFM技术在纯化和精制生物活性肽中取得了突破性进展，因为它是可信赖的、划算的、高效率的分离技术，特别是相对于传统的色谱分析法。应用前景是非常可观的，该工艺技术在某些地方已得到证实如烟草多酚类、绿茶儿茶素、原花青素和壳聚糖低聚物等。,连续分离酸性多肽电渗析槽图解,同时连续分离酸性和碱性多肽的电渗析图解,ED技术的特点,能耗低 在除盐过程中，只是用电能来迁移水中的盐分，而大量的水不发生相的变化。尤其适用于苦咸水淡化；药剂耗量少，环境污染小 仅在酸洗是时消耗少量酸；对原水含盐量变化适应性强 可按需要进行调节，根据一台ED器中的段数、级数或多台ED器的串联、并联或不同除盐方式（直流式、循环式或部分循环式）来适应；操作简单，易于实现机械化、自动化；设备紧凑耐用，预处理简单 预处理一般经砂滤即可；水的利用率高 ED器运行时，浓水和极水可循环使用，水的利用度可达70%80%，国外可高达90%左右。,ED技术的特点（续）,不足之处：只能除去水的盐分，而不能除去其中的有机物，某些高价离子和有机物还会污染膜；易发生浓差极化而产生结垢（用EDR可以避免）；与RO相比，脱盐率较低，装置比较庞大且组装要求高，因此它的发展不如RO快。,利用ED技术实现氨基酸的分离,ED技术用途归纳,把溶液中部分电解质离子转移到另一溶液系统中去，并使其浓度增高，或参加反应等，如从海水中抽取氯化钠；从有机溶剂中去除电解质离子，如乳清脱盐、氨基酸提纯等；电解质溶液中，同电性但具有不同电荷的离子的分离，如从海水提取一价盐等。,4 膜分离技术的未来发展趋势,从蛋白质水解生产生物活性肽已经实现，但是依然受限于适合大规模生产的技术。膜分离技术首先可用于蛋白质和高分子的分离，如天然的牛奶、蛋白质原料有不同的理化性质可以进行分离。事实上，活性序列的大小从2到20个氨基酸残基不等，许多多肽显示出多种性质，但是这些性质区别很小而且这些多肽还混在原料中，从而分离很困难。,4 膜分离技术的未来发展趋势,现在，超滤根据分子量大小能很好的浓缩多肽，电渗析和超滤膜的联用，有更高的选择性，能更好的促进分离，但是，实现大规模生产还需要确定其可行性。这个领域的发展前景主要是理解膜和多肽的相互作用以及膜材料的研究或者通过凝胶剂增加或限制它们的相互影响来提高选择性和活性肽的收率。此外，另外一个可能提高活性肽选择性的方法是让多肽与其它多肽或大分子的多糖类进行非长久紧密性连接，这种连接可改变它们的类似性或者分子大小，从而促进分离。从水解原料蛋白质开始，控制水解变量确定多肽产品方向促进它们的分离也是一种新的研究方式。,Thank You!,