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分析方法开发和验证,验证前需要考虑的事情,概念 分析方法形成过程 验证需要考虑的因素 验证基本假设（前提）现有验证指南缺陷 分析方法验证方案内容 仪器的确认,概念 1：分析方法,ICHQ2定义：分析方法是指进行分析的方式，应详细描述每一个分析试验所必需的步骤它包括，但不局限于：样品，参照对照品，试剂的配制，仪器的使用，标准曲线的绘制，计算公式的运用等,概念2 分析方法验证,化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则定义：为使测试结果准确，可靠，必须对所采用的分析方法的科学性，准确性和可行性进行验证，以充分表明分析方法符合测试项目的目的和要求，这就是通常所说的对方法进行验证,分析方法形成过程,什么情况分析方法需要验证？,刚开发的分析方法修正或建立分析方法用于新的问题分析方法变更分析方法在不同实验室，分析人员使用不同仪器证明两个分析方法的等效性,验证需要考虑的因素,确认并校验的仪器文件化的方法可靠地参数标准品合格的分析人员样品完整性,验证基本假设 前提）,专属性得到证明方法己经是最佳条件用统计学方法处理数据,现有验证指南缺陷,仅仅提出了要求验证的项目没有给出具体的验证方法没有给出判断标准一些验证中的实际问题没有指导原则,分析方法验证方案内容,阐明目的和范围责任书面的分析方法使用的物料与仪器目录每一参数的实验程序统计方法每一参数的验证标准,仪器的确认,构造，型号和制造商手册改造安装确认和运行确认校准程序维护保养养计划,不同验证具体要求,验证的范围新方法验证步骤方法转移验证方法重新验证,验证的范围,新方法要求进行完整的验证药典的方法要求部分进行验证（确证）重大要的变化需要进行部分再验证,新方法验证步骤,开发新方法或从相关实验室获得新方法制定验证方案，验证规程或验证主计划确定方法（验证）适用的目标，范围确定实验参数及可接受的标准确定验证实验过程确认验证使用的仪器相关性能,新方法验证步骤（续1）,确认验证所需的人员，试剂及标准运行预验证试验如果需要调整方法或接受标准运行完整的验证试验建立该方法的SOP用于日常分析工作确定需要重新验证方法的标准,新方法验证步骤（续2）,确定日常工作中系统适应性测试及/或分析质量控制检查的类型及频率将验证过程，结果及结论总结形成完整的验证报告,概念3：替代分析方法,FDA定义：目的在于替代法规分析方法的分析方法,基本内容,专属性检测限定量限精密度线性与范围准确度耐用性,分析方法按特性分类,第一类主成分定量第二类杂质或降解产物测定第三类性能特点测定第四类鉴别试验,ICH,USP及WHO验证要求,FDA要求验证项目,ICH要求验证项目,WHO要求验证项目,方法转移验证,证明经过其它实验室的验证，并可以正式运行的分析测试过程，是否可以在本实验室运行，并适应实际的使用情况：满足相应的测试要求 真实反映被测物相应的特性，浓度，质量，纯度及效价情况,概念 4：法规分析方法,FDA 定义：是用于评佑原料药或制剂某一个规定特性的分析方法,概念5:交叉验证,FDA定义：在同一个研究或不同交叉研究中，用两种或多种分析方法进行分析，对验证参数进行比较,转移验证方法来源,官方认可的标准 USP/NFEPBPChPJPAOAC客户提供的，经过验证后的方法相关实验室经验证后正在使用的方法,转移验证的要求,系统适应性及方法专属性必须验证方法耐用性可以不验证杂质测试方法检测限与定量限必须验证其它验证项目根据实际情况决定，对于项目的选择与取舍应有详细的讨论,分析方法转移验证,分析方法转移方案及程序精密度准确度耐用性编写并批准的具体测试方法熟练程度核实新实验室正式验收,方法再验证,概念需运行方法再验证的变更情况方法再验证要求,概念 6：方法再验证,化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则定义：在某些情况下，如原料药合成工艺改变，制剂处方改变，分析方法发生改变等，均有必要对分析方法再次进行全面或部分指标的验证，以保证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证,需运行方法再验证的变更情况,改变药物合成工艺改变制剂组成改变分析过程操作过程的更改改变仪器，色谱柱等硬件测试条件持续改变以适应系统适应性要求，且改变程度超出药典规定的方法耐用性验证范围,方法再验证要求,证实相应的变更发生后，原使用的分析测试过程：能够继续保持其特有的性质（如专属性）能够继续真正反映被测物的相应特性（检测限与定量限）依靠变更情况确定重新验证的内容与程度,其它,概念参考文献,概念 7：系统适应性,在一个系统（主要是色谱分离系统）被使用前，检查其系统性能指标是否满足分析要求的过程它是确保色谱系统质量性能的要素,概念8：接受标准,FDA定义：用于验收分析结果的数字限度，范围，或其他适当的计量,参考文献,ICH 一 QZA Text on Validatlon of Analytical Procedure:(1994)ICH 一 QZB Validation on AnaIytical Procedures:Methodology：(1995)CDER Reviewer Guidance:Validation of ChromatographicMethod(1994)CDER Submitting Samples and Analytical Data for MethodValidations（1987)CDER Draft Analytical Procedures and Method Validation(2000)CDER Bioanalytical Method Validation for Human Studles(1999)USP Vaildation of Compendial Methods(current revlsion)中国药典：药品质量标准分析方法验证,Validation of Analytical Procedure分析方法验证 第一部分：基本要求,Validation of Analytical Procedure分析方法验证 第二部分：实验设计与操作,1.0讲座目的,掌握验证试验设计 掌握验证试验操作 了解确定接受标准原则,第一部分:基本要求,Validation of Analytical Procedure 分析方法验证,第二部分:实验设计与操作,1.0讲座目的 掌握验证试验设计 掌握验证试验操作 了解确定接受标准原则,2.0 一精密度,概念容易混淆的精密度中术语重复性中间精密度推荐重复性接受标准 AOAC 浓度与精密度关系重现性,2.1 一概念 1：精密度,lCH-Q2 定义：分析方法的精密度指在规定条件下，对均质样品，多次取样进行一系列检测结果的接近程度（离散程度）,2.2 一容易混淆的精密度中术语,仪器重复性相同人员，仪器，日期，标准液方法重复性相同人员，仪器，日期，重新配制标准液中间精密度不同日期，不同分析人员，不同仪器,2.3 一重复性,概念推荐重复性测定方法,2.3.1 一概念 2：重复性,ICH-Q2 定义：重复性是指在同样的操作条件下，较短时间间隔的精密度,2.3.2 一推荐重复性测定方法,在方法规定的线性范围内重复测定如 3 个浓度，每个浓度 3 次或 100 的测试浓度，测定六次记录每次测定各组分响应计算各响应值与平均值之间相对标准偏差,概念3：系统重复性,相同条件下，同一分析人员对同一样品溶液多次测试结果的接近程度,2.3.2.2 系统重复性实验,取同一均匀标准样品溶液连续重复测定六次记录每次测定各组分响应计算各响应值与平均值之间相对标准偏差,概念4：方法重复性,相同条件下，同一个分析人员对同一个均匀样品，多次取样测定所得结果的接近程度,2.3.2.4 一方法重复性实验,取同一批号均匀样品按照分析方法规定至少称量出六份按含量测定方法测定每一份样品含量计算每一次测定的含量与平均含量之间的相对标准偏差,2.4-中间精密度,概念推荐中间精密度测定方法,2.4.1 一概念 5：中间精密度,ICH-Q2 定义中间精密度指的是试验室内部条件改变，如：不同日，不同分析者，不同仪器等情况下的精密度,2.4.2 推荐中间精密度测定方法,应确定随机事件对分析方法精密度的影响，如不同日期，不同分析人员，不同仪器等等没有必要一一考察用均匀设计，或正交设计方法,2.5 一推荐重复性接受标准,系统重复性 S/N1000,RSD S/N100,RSD2%S/N10,RSD4%S/N10,RSD8%方法重复性 测定结果的相对偏差 仪器分析小于2%容量分析小于0.3%,2.6 AOAC 浓度与精密度关系,2.7-重现性,概念 什么时候需要作重现性,2.7.1 一概念 6：重现性,ICH Q2定义：重现性指不同试验室之间的精密度,什么时候需要作重现性？,是比较实验室间的差异当一个方法要升级到法规方法时，需要做这个工作,3.0 准确度,概念原料药准确度测定制剂产品准确度测定杂质准确度测定推荐准确度测定方法推荐准确度测定接受标准AOAC 浓度与回收率关系,3.1 概念 7：准确度,ICHQ2 定义分析方法的准确性指的是真实值或认可的参考值与测量值之间相近程度,3.2 原料药准确度测定,用该方法分析已知纯度的分析物该方法的分析结果与成熟的分析方法相比较，该成熟方法准确度是已知的在精密度，线性，专属性建立后，进行推论,3.3 制剂准确度测定,用该方法去测按处方量制成的混合物（加入已知量被测物）在制剂中加入已知量主药或与另一成熟方法比较在精密度，线性和专属性建立后得出,3.4 杂质准确度测定,在样品（原料浩挤）中加入已知量的杂质无法得到杂质降解物的，与采用其他方法测得的结果比较，可以使用原料的响应值,3.5 推荐准确度测定方法,在六个空白样品中，分别加入已知浓度的样品（浓度范围为含量测定浓度的 80120%)计算该方法的百分回收率,3.6推荐准确度测定接受标准,测定得到的主品的百分回收率与理论回收率100%间的相对标准偏差不得大于方法重复性相对标准偏差的4倍,3.7AOAC浓度与回收率关系,4.0 检测限,概念直观法信噪比法标准偏差和斜率法推荐检测限测定方法,4.1概念 8：检测限,ICH Q2 定义检测限度指的是样品中的被分析物质能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量,4.2 直观法,直观评价可以用于非仪器分析方法，也可用于仪器分析方法检测限的测定是通过对一系列已知浓度被分析物的样品进行分析，并以能准确（或被可靠）地检测被测物的最小量或最低浓度来建立,4.3 信噪比法,用于能显示基线噪音的分析方法把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较算出能被可靠地测出的最低浓度或量一般以信噪比为3：1或2：1时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限,4.4 标准偏差和斜率法,根据响应值的标准偏差和斜率检测限度（DL）=3.3/s：响应值的标准偏差（通过空白样品测背景响应值或Y轴截距）s：校正曲线的斜率（通过被测物的校正曲线求得）,4.5 推荐检测限测定方法,在最灵敏的仪器状态下测定至少四个空白样品洗脱时间需要覆盖整个样品中所有组分的样品溶液每个样品进样三次计算该组分的最小检测限,5.0定量限,概念推荐定量限测定方法,5.1 概念 9：定量限,ICH Q2 定义：某种分析方法的定量限度是指具有合适准确性和精密度的条件下，能够定量测定分析组分的最低限量。它是样品中含量低的化合物定量分析的参数，特别适用于杂质和（或）降解产物的测定,5.2 推荐定量限测定方法,按检测限方法测定仪器的平均噪声然后按信噪比等于10.00.5配置样品溶液连续进样三次计算组分的最小定量限,6.0 耐用性,概念变动因素色谱分析中耐用性项目,6.1 概念10:耐用性,ICHQ2 定义分析方法的耐用性是指试验参数适当地发生细小改变时，测量能力保持不受影响，可用于说明正常使用时的可靠性,6.2 变动因素,流动相的组成pH值不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱柱温流速等,6.2 变动因素,典型气相色谱法变动因素载气流速不同厂牌或批号的色谱柱固定相担体柱温进样口检测器温度,6.3色谱分析中耐用性项目,7.0 线性度,概念线性范围推荐线性度测定方法推荐线性度测定接受标准,7.1 概念11：线性度,ICHQ2 定义分析方法的线性是指在给定的范围内检测结果与样品中被分析物的浓度（含量）成比例关系的能力,7.3 推荐线性度测定方法,在含量测定浓度的70%-130%或50%-150%均匀选择至少六个不同的浓度点每一个尝试至少需要测定四次记录各对应浓度下的响应值,7.2 推荐线性度测定接受标准,相关系数应当在0.999与1.000 之间经线性回归处理其截距不应明显地偏离零点,8.0 专属性,概念推荐专属性测定方法降解研究内容,8.1概念13：专属性,ICH-Q2定义 专属性是指在一些可能存在的组分，如杂质，降解物，基质等存在时，对被分析物准确可靠测定的能力,8.1推荐专属性测定方法,按照规定的标准或参考文献的色谱分析方法分别将原料药，中间体，可得到杂质，原料，中间体，前体及降解产物的样品分别进样记录各物质的相对保留时间确保各样品之间的峰可以分开至少确保其他物质的峰与主峰分开,8.2 概念 14：稳定性指示性分析方法,FDA定义稳定性指示性分析方法是一种验证了的定量分析方法，其能够测定原料药或药品在有关性质的变化一个稳定性指示性分析能在没有降解产物，工艺杂质，辅助材料或其他的杂质干扰下，准确地对活性成分进行测量,8.3 降解研究目的,降解途径影响因素确定包装分析方法专属性,8.4 降解研究内容,光酸碱氧化还原高热高湿,Validation of Analytical Procedure分析方法验证 第二部分：实验设计与操作,Validation of Analytical Procedure分析方法验证 第三部分：盐酸氟西汀验证实例,1.1 目的,掌握色谱方法验证所需要的项目掌握色谱验证基本实验方法了解稳定性指示性方法验证的要求了解析因分析在验证中应用,1.2 简介,美国某公司生产10mg和20mg盐酸氟西汀两种相胶囊其重量与配方相同仅盐酸氟西汀与辅料比例不同所验证方法时公司内部对美国和欧盟市场产品放行和稳定性研究中使用的含量和杂质分析的方法该分析方法已经建立,1.3 验证项目清单,1 精密度 2 线性 3 范围 4 准确性 5 低浓度盐酸氟西汀验证6 m-盐酸氟西汀验证 7 选择性 8 耐用性,2.0 精密度,项目：系统重复性方法重复性中间精密度,2.1 系统重复性,方法按照分析方法要求，配制盐酸氟西汀标准溶液重复进样 5 次计算峰面积平均值与相对标准偏差,2.2 方法重复性,方法按照分析方法要求，分别配制 20mg 盐酸氟西汀样品溶液 6 个分别进样计算含量相对标准偏差,2.3 中间精密度,方法由另外一个分析员，在不同日期，另外的仪器上，按照分析方法 分别配制 20 mg 盐酸氟西汀样品溶液 6 个计算 含量及相对标准偏差,3.0 线性,方法正常含量分析用标准溶液浓度的 50到 200%范围内均匀选择 6个点并配制相应浓度的盐酸氟西汀含量标准溶液分别进样计算线性回归分析相关系数，斜率，Y轴截距,4.0 范围,方法正常20mg样品含量分析浓度50到200范围内均匀选6个点配制盐酸氟西汀样品溶液分别进样计算线性回归分析相关系数，斜率，Y轴截距,5.0 准确性,项目 标准品准确性 样品准确性,5.1 标准品准确性,方法按照分析方法要求，配制盐酸氟西汀标准溶液重复进样 5 次计算 准确性测定浓度值用峰面积按照回归方程进行计算,5.2 样品准确性,方法按照产品标准量，在70到180正常标示量选均匀选择 4 个点，混合辅料与及盐酸氟西汀每点3个样品，分别进样计算 回收率测定浓度值用峰面积按照回归方程进行计算,6.0低浓度盐酸氟西汀验证,项目：线性准确性系统重复性定量限度检测限度,6.1 线性,方法按照分析方法要求，均匀选择 6个点配制标示量的 0.02到 1.0 含量标准溶液分别进样计算线性回归分析相关系数，斜率，Y袖截距,6.2 准确性,方法配制杂质浓度的标准溶液进样6次计算按峰面积用回归线性方程来计算测量浓度平均值，相对标准偏差,6.3 系统重复性,方法配制工作浓度的 0.02和 0.05标准溶液分别进样6次计算峰面积的平均值与相对标准偏差,6.4 定量限度,用系统重复性实验中的标准偏和线性回归 方程中的斜率差计算,6.5 检测限度,用系统重复性实验中的标准偏和线性回归 方程中的斜率差计算,7.0 m-盐酸氟西汀验证,项目：线性检测限度定量限度准确性精密度方法重复性中间精密度,7.1 m-盐酸氟西汀简介,M-盐酸氟西汀是产品中的一个杂质m-盐酸氟西汀在0.05-1.0区间呈线性相对响应因子（对盐酸氟西汀）F=132.73952/74859534=1.8,7.2定量限度,根据 盐酸氟西汀定量限相对响应值计算盐酸 m-氟西汀定量限度,7.3 检测限度,根据 盐酸氟西汀检测限度 相对响应值计算盐酸 m-氟西汀检测限度,7.4回收,方法分别6个标空白中加0.05的 m-盐酸氟西汀进样计算 回收率实际检测值用峰面积按照回归线性方程计算,7.5准确性,方法在已知 m-盐酸氟西汀含量的样品中分别在0.4%,0.5和 0.6%3 个水平加入 m-盐酸氟西汀标准品每组3个样品中计算回收率实际检测值用峰面积按照回归线性方程计算,7.6 重复性,项目方法重复性中间精密度,7.61方法重复性,方法按照要求配制溶液反复进样6次计算平均值标准偏差相对标准偏差,7.62 中间精密度,方法另外一个分析员，在不同日期，另外的仪器上按照方法重复性方法配制溶液6次分别进样计算含量及相对标准偏差,8.0 选择性,1.降解 2.系统适用性 1）原样 3.空白 2）酸降解 4）氧化降解 5）日光降解 6）溶液加热降解 7）粉末加热降解,8.1 简介,降解产物的选择性试验是分析方法稳定性指示性验证的一个重要部分主要目的是通过试验证明各种降解的产物与所要分析的物质库完全分开本试验中的主要设备是二极管矩阵检测器并通过计算：纯度角，匹配角，纯度阈值匹配阈值，含量来证明峰的纯度,8.2原样品,方法20mg胶囊按照规定的方法进行分析标准品按照规定的方法进样分析,8.3 酸降解,方法：样品：称量大约等量20mg的样品，转移到 50ml 容量瓶中，加入20ml 稀释剂，并超声处理10分钟。加 lml的浓盐酸。放置18小时。用 10N 氢氧化钠中和到 pH 5.5。稀释到刻度。过滤。标准品：称量大约22mg 的标准品，转移到 50ml 容量瓶中，加入 20ml稀释剂，加2ml 的盐酸。放置18小时。用10N氢氧化钠中和到 pH5.5。稀释到刻度。,8.4碱降解,方法：样品：称量大约等量20mg的样品，转移到50ml容量瓶中，加入20ml 稀释剂，并超声处理10分钟。加 lml 的5N氢氧化钠。放置18小时。用5N盐酸中和到 pH 5.5。稀释到刻度。过滤。标准品：称量大约22mg的标准品，转移到50ml容量瓶中，加入20ml 稀释剂，加2 ml的5N氢氧化钠。放置18小时。用5N盐酸中和到 p H5.5。稀释到刻度。,8.5氧化降解,样品：称量大约等量20mg的样品，转移到50ml容量瓶中，加入20ml 稀释剂，并超声处理10分钟。加 lml 的30%过氧化氢。放置5小时。稀释到刻度。过滤。标准品：称量大约22mg的标准品，转移到50ml容量瓶中，加入20ml 稀释剂，2 ml的30%过氧化氢。放置5小时。稀释到刻度。,8.6光降解,方法：样品：称量大约等量20mg的样品在500w/hr.Cell下曝光1小时。设定BST35,ACT45。标准品：称量大约等量20mg的样品。在 500500w/hr.Cell下曝光 1.5小时。设定BST35,ACT42。,8.7溶液加热降解,方法：样品：称量大约等20mg的样品，转移到50ml容量瓶中，加入 20ml 稀释剂，并超声处理10分钟。稀释到刻度。取4ml溶液并转移到坩埚内。与105加热2小时。冷却到室温。过滤。标准品：4ml的工作标准液转移到坩埚内。与105加热2小时。冷却到室温。过滤。,8.8粉末加热降解,方法：样品：称量大约等量20mg的样品，转移到合适的试管中。于100加热4小时。冷却到室温。转移到50ml容量瓶，加入20ml稀释剂，并超声处理10分钟。稀释到刻度。过滤。标准品：称量大约等量45mg 的标准品，转移到合适的试管中。于 100加热4小时。冷却到室温。转移到100ml 容量瓶。稀释到刻度。过滤。,8.9系统适应性,系统适应性按照规定方法进行。氟西汀与m-氟西汀间分离度不小于2.0。氟西汀峰拖尾因子应不大于2.0。氟西汀的典型保留时间大约在9.5到10.0分之间。,8.10空白,分析两个批号的空白与氟西汀，并分析混合样品没发现干扰峰,9.0标准与样品溶液的稳定性,项目标准溶液样品溶液,9.1标准溶液稳定性,方法：配制标准溶液，冷藏于4-8放置30天以上与两个新配制的标准溶液一道测试,9.2样品溶液稳定性,方法配制样品溶液，冷藏放置48小时重新分析,10.0耐用性,方法取三个样品，按照要求配置溶液，但超声分为5，10，和15分钟每个样品测定3次,10.1提取效率,方法取三个样品，按照要求配置溶液，但超声分为5，10，和15分钟每个样品测定3次,10.2析因设计因素,10.3析因设计参数,流动相构成流量参数柱温柱生产商,10.4柱生产商,10.5析因设计,讨论,本验证方法中有什么优点，缺点？什么项目的方法可以改进？我们自己所做的验证有什么不足？,谢谢大家！,