分子遗传学第6章蛋白质翻译.ppt

1,6.1 基本概念6.2 遗传密码6.3 tRNA的功能6.4 核糖体的结构6.5 原核生物的翻译过程6.6 真核生物的翻译过程6.7 翻译初始产物的后加工,第6章 蛋白质翻译（Protein Translation）,2,3,4,典型的酶作用机制,酶等待着被作用的分子来临,成为一个新分子放出来,5,蛋白质的一级结构：又称初级结构或化学结构，是指组成蛋质分子的多肽链中氨基酸的数目、种类和排列顺序，多肽链的数目，同时也包括链内或键间二硫键的数目和位置等。,蛋白质的二级结构：是指多肽链本身折叠和盘绕方式，是指蛋白质分子中的肽链向单一方向卷曲而形成的有周期性重复的主体结构或构象。,蛋白质的三级结构：是指在二级结构的基础上，进一步卷曲折叠，构成一个很不规则的具有特定构象的蛋白质分子。,蛋白质的四级结构：是由两条或两条以上的具有三级结构的多肽聚合而成特定构象的蛋白质分子。构成功能单位的各条肽链，称为亚基，一般地说，亚基单独存在时没有生物活力，只有聚合成四级结构才具有完整的生物活性。,6,7,基因表达的第二步,指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位 点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原 则，依次合成一条多肽链的过程,参与翻译的RNA分子有tRNA、rRNA和mRNA,tRNA 通过 anti-codon(反密码子)识别codon,6.1 基本概念,tRNA的功能是转运氨基酸，mRNA作为翻译的 模板，rRNA与多种蛋白质组成核糖体作为蛋白 质合成的场所,翻译的起始,核糖体与mRNA结合并与氨基酰-tRNA生成起始复合物,蛋白质的生物合成是一个比DNA复制和转录更为复杂的过程。,Polycistronic transcripts in prokaryotes,9,核糖体沿mRNA5 端向3 端移动，开始了从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段,肽链的延伸,10,肽链的终止及释放,核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反应,11,6.2.1 通用遗传密码(Universal triplet codon),特征,codon是mRNA 上连续排列的三个核苷酸序列，并编码一个氨基酸信息的遗传单位,codon具有四大生物系统（细菌、病毒、动物、植物）的通用性与保守性（除mt）,在一个基因序列中 codon具有不重叠性和无标点性,6.2 遗传密码(genetic codon),遗传密码是三联体的推测 1954年俄裔美国大爆炸理论物理学家伽莫夫（G.Gamow）在自然杂志发表 脱氧核糖核酸与蛋白质之间的关系 论文，提出遗传密码的构想，认为在DNA的双螺旋结构中，四个碱基之间形成一定空穴,游离氨基酸进入空穴形成多肽链，四个碱基中由三个碱基决定一种氨基酸，因为氨基酸有20种。一个碱基决定一种氨基酸时只能决定41=4种 两个碱基决定一个氨基酸时只能决定42=16种 三个碱基决定一个氨基酸时能决定43=64种 四个碱基决定一个氨基酸时能决定44=256种,13,遗 传 密 码,阅读方向为5-3,14,20种氨基酸侧链集团的大小和极性,15,起始密码的确定：1966年，剑桥分子研究中心等发现在体内进行合成的多肽链，其开头在细菌都为甲酰甲硫氨酸，在真核生物都为甲硫氨酸，且都是从AUG这个密码子开始，因此，把AUG定为起始密码子。,终止密码子的推测：Nirenberg、Khorana的试验都发现UAA、UAG、UGA三个密码子不能代表任何的氨基酸。E.Coli的Trp 突变株不能合成色氨酸合成酶蛋白，对他进行诱变可得到回复突变，回复突变有两种类型：个别氨基酸发生了变化。另一种为完全回复，没有任何氨基酸组成的变化。说明Trp不是任何移码突变，从后一种推测可能存在终止密码,17,终止密码子的破译：1965年剑桥分子研究中心的Brenner,发现 E.coli一些无义突变型是在色氨酸位置上变化,由UGG 变成UGA，把UGA定为终止码 在酪氨酸位置上变化，由UAC、UAU变成UAA、UAG，所以把UAA、UAG码子也定为终止密码,密码子通用性的例外情况密码子 通用情况 例外情况 例外的生物UGA 终止子 色氨酸 人酵母线粒体支原体UGA 终止子 半胱氨酸 纤毛虫核基因组 CUA 亮氨酸 苏氨酸 酵母线粒体 AUA 异亮氨酸 甲硫氨酸 人线粒体AGA 精氨酸 终止子 人线粒体AGG 精氨酸 终止子 人线粒体GUG 缬氨酸 丝氨酸 假丝酵母核基因组UAA 终止子 谷氨酸 草履虫四膜虫核G UAG 终止子 谷氨酸 草履虫核GAAA 赖氨酸 天冬氨酸 果蝇线粒体CUG 亮氨酸 终止子 圆柱念珠菌核GCUN 亮氨酸 苏氨酸 酵母线粒体,19,2、第二遗传密码（表观遗传密码）决定多肽链折叠形成有功能蛋白质的遗传信息，蛋白质一级结构决定其空间结构的密码,20,由DNA序列以外的化学标记编写的、控制表观遗 传印记的另一类遗传密码,遗传密码是遗传信息从DNA RNA 流向蛋白质，是明码，又叫第一遗传密码，是遗传信息传递的第 一层次 第二遗传密码是遗传信息从蛋白质氨基酸序列到蛋 白质的空间结构功能，也既蛋白质分子折叠是遗传 信息传递的第二层次 中心法则解决了蛋白质的形成，但没有解决蛋白质 如何折叠形成功能蛋白质，给后人留下了新的难 题，从遗传信息到生物功能研究就是研究蛋白质分 子折叠机制，既破译第二遗传密码,22,我国中科院院士皱承鲁领衔此课题，有望破译。现已经发现第二遗传密码有三个特性简并性：不同序列对应相同结构多义性：类似序列具有不同结构全局性：局部序列改变会影响整个结构,23,6.2.2 Degeneracy of codon(密码子的简并性),（1）概念,密码子的简并性：多种codons编码一种氨基酸的现象,同义密码子(synonyms)：代表同一种氨基酸的密码子,61个密码子编码常规的20种氨基酸，3个为肽链终止密码子,简并性具有的生物学意义：允许生物体的DNA碱基有较大变异的余地，使基因突变可能造成的危害降至最低，而不影响物种性状的表达，对环境的适应性和物种遗传的稳定。,多个遗传密码编码同一种氨基酸的现象 简并的例子 氨基酸 密码子数 氨基酸 密码子数 丝氨酸 6 天冬氨酸 2 亮氨酸 6 酪氨酸 2 精氨酸 6 组氨酸 2 脯氨酸 4 谷氨酸 2 苏氨酸 4 赖氨酸 2 丙氨酸 4 谷氨酰胺 2 甘氨酸 4 天冬酰胺 2 缬氨酸 4 半胱氨酸 2 异亮氨酸 3 色氨酸 1 终止码 3 甲硫氨酸 1 苯丙氨酸 2,25,（2）简并现象的机理,同功受体（Isoacceptor）：负载同一氨基酸，但识别 不同密码子的tRNA。同功tRNA间存在结构上的差异，反密码子也可不同,Wobble hypothesis;tRNA 的 反密码子中:密码子 1th(Nt34):3 rd-Nt,3 isoacceptors,1 codon family 2 extra codons,26,Wobble base的摇摆配对原则,摆动假说由Crick.F 1966年 提出。即当tRNA的反密码子与mRNA的密码子配对时前两对严格遵守碱基互补配对法则，但第三对碱基有一定的自由度可以“摆动”。,27,3）简并性的相对性 双关密码子:（ambiguous codon）多义密码子 能编码一种以上氨基酸的密码子 例如密码子UUU能编码笨丙氨酸，偶而 也能编码亮氨酸。机制在于UUU码子可 被一种以上tRNA识别，也说明很早以 前UUU就是亮氨酸的密码子,28,6.2.3 Anti-codon及其两侧碱基修饰对密码子 解读的生物学意义,Xo5U(5-羟基尿苷)Cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)mCm5U(5-甲氧基羰甲基尿苷)Xm5s2U(5-甲基-2硫代尿苷)K2C(2-赖氨酸胞苷)Com5U(5(2)-羟羧甲基尿苷)I(Inosine次黄嘌呤),m7G(7-甲基鸟苷)m5C(5-甲基胞苷)m6A(6-甲基腺苷)s2C(2-硫代胞苷)(假尿苷)Um(2-O-甲基尿苷)Q(Queuosine),a)Methylated Nt at anti-codon and flanked,29,Xo5U(5-羟基尿苷)Cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)mCm5U(5-甲氧基羰甲基尿苷)Xm5s2U(5-甲基-2硫代尿苷)K2C(2-赖氨酸胞苷)Com5U(5(2)-羟羧甲基尿苷)Um(2-O-甲基尿苷)I(Inosine次黄嘌呤),30,c)tRNA中anti-codon碱基修饰的意义,限制对密码识读的随意性，以保证遗传的稳定,提高摇摆能力，防止突变效应，以保证遗传的稳定,保证正确的读码框架，以保证遗传的稳定,anti-codon两侧的碱基亦被称为扩展的反密码子,31,6.3 tRNA的功能,为每个三联体密码子翻译成氨基酸提供了接合体 为准确无误将所需aa运送到核糖体提供了运送载体 tRNA种类繁多，并与多种蛋白质和核酸相互识 别，决定了它们在结构上存在大量的共性,tRNA的结构“四环一臂”倒L形的三级结构,33,沉降系数 S 生物大分子在离心场中沉降，受到三种力的影响，它们是离心力，浮力和摩擦力。物质在单位离心力场的沉降速度是个定值，称为沉降系数（sedimentation coefficient）。蛋白质、核酸等的沉降系数在1 X 10-13到 200 X 10-13秒 之间。为方便将10-13秒作为一个单位，称Svedberg单位，用S表示。其数值不仅与物质分子的质量有关，也与分子的形状有关。,34,小RNA;4S,tRNA phe,77Nt,cloverleaf form(1964 Holly R.),二级结构为三叶草形 5 arms&4 loops,Nt more modified by methylation,6.3.1 tRNA的高级结构,32 tRNA in universal codons,35,36,37,tRNA的“倒L”三维结构与功能,“L”构型的结构力,二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键,二级结构中非双链区在“L”结构中，形成氢键结合,38,-aa accept arm 位于“L”的一端，契合于核糖体的肽基 转移酶结合位点 P A,以利肽键的形成,-anti-codon arm 位于”L”另一端，与结合在核糖体 小亚基上的codon of mRNA配对,39,-“L”结构中碱基堆积力大 使其拓扑结构趋于稳定 wobble base 位于“L”结构末端 堆积力小 自由度大 使碱基配对摇摆,-TC loop&DHU loop 位于“L”两臂的交界处，利于“L”结构的稳定,40,6.3.2 tRNA的种类,（1）起始tRNA和延伸tRNA能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。（2）同功tRNA同功tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别。（3）校正tRNA 校正tRNA分为无义突变及错义突变校正tRNA。,41,6.3.3 氨酰基tRNA合成酶 aa-tRNAaa synthetase(AARS),催化氨基酸与tRNA间的反应生物体有20种氨酰基tRNA合成酶，分子量相差很大一种合成酶只能识别一种氨基酸和该氨基酸的几种同功tRNA将tRNA分为20个同功tRNA组,42,氨酰tRNA合成酶有三个结合位点：氨基酸结合位点、ATP结合位点、tRNA结合位点催化反应分两步：第一步：氨基酸和ATP形成相应腺苷酸化氨酰基，释放焦磷酸第二步：活化型的氨基酸被转移至tRNA，释放AMP,43,-由若干Nt组成，存在于tRNA不定位置上,-与AARS侧链基团的分子发生特异的“契合”,-成为tRNA准确负载氨基酸的机制之一,6.3.4 Paracodon（副密码子）,定义：tRNA上被氨酰基tRNA合成酶所识别的碱基，功能是促进tRNA与所携带氨基酸的准确识别,44,paracodon 的特征,-被同一种AARS 所识别的一组同功受体具有相同的副密码子,-paracodon 是为AARS 特定氨基酸所识别的若干碱基（并非均为一对核苷酸）,-paracodon位于tRNA 的各种环或臂上，不同tRNA 的 paracodon 的定位不同,-AARS 对paracodon 的识别与结合是通过氨基酸与碱基 之间的连接实现的,45,a)tRNA abundance 正相关 codon usege,b)需要量多的蛋白质（除mRNA转录速率高外）,需要量少的蛋白质（除mRNA转录速率低外）,6.3.5 tRNA 的丰富度与codon 的使用频率(bias),-识别同一氨基酸的不同tRNA(isoacceptor)量不等,-不同生物间同一isoacceptor的量不等,46,自然选择codon/anti-codon 间适度结合强度的codon usage以保证最佳的蛋白质合成速率,tRNA abundance;codon usage(codon bias)是进化中形成的基因表达调控机制之一,47,1209 codons,48,Codon usage in the genes of Animals,2244 codons,49,6.3.6 two of three codon-reading in mitochondrial,a)线粒体中具有与通用密码不同的编码信息,线粒体中codon较为整齐（均为2/4/6）,2 codon;F,I,Y,H,Q,N,E,k,D,W,M,C 1个tRNA4 codon;V,P,T,A,R,G,(family)Leu,Ser(2 isoacceptors each)2个tRNA,In mt 22 tRNA only(32 tRNA in universal codons),线粒体“三中读二”方式可减少tRNA,50,51,Codon-reading,two of three reading,codon UCU-UCA-UCG-UCC,摇摆性的“三中读二”原则：密码子的1、2位碱基与反密码子能形成6个氢键 时，可三中读二，如：CCX,CGX,GCX,GGX 密码子的1、2位碱基与反密码子能形成4个氢键 时，不可三中读二，AAX,AUX,UAG,UUX 密码子的1、2位碱基与反密码子能形成5个氢键时 分两种情况：当第二个碱基为嘧啶时可三中读二，如 UCX,ACX,CUX,GUX。当第二个碱基为嘌呤时 不可三中读二，如CAX,GAX,UGX,AGC 原核生物、真核生物只有大约30种反密码子，而密 码子却有61种，反密码子少的原因就在于反密码子 具有摇摆的特性,53,mt tRNA 与通用 密码 tRNA 的结构差异,-no TC loop in mt-tRNA,-no DHU loop in some mt-tRNA,-G+C/A+U=0.250.94 in mt-tRNA,G+C/A+U=12 in universal tRNA U含量高，二级结构松弛，对 codon family的识读具有更大的摇摆性。,54,所有mRNA都具有两个必须特征：一段可翻译的密码子序列（开放阅读框，open reading frame，ORF）和一个核糖体结合位点（ribosome binding site,RBS）在原核生物和真核生物间有重要区别原核生物mRNA的第一个密码子AUG上游的重要特征是SD序列真核生物mRNA除第一个密码子AUG的上游是核糖体小亚基扫描AUG的信号序列（CCACC）外，5端非翻译区上游为帽子结构，3端非翻译区内有多聚腺苷化的信号AAUAAA以及其下游的多聚A尾巴,6.3.7 mRNA,55,In Prokaryote,Shine-Dalgarno seq.(S.D seq)：只存在于原核生物中，在mRNA起始密码子AUG的上游约10个核苷酸处含有一段富含嘌呤核苷酸的序列，能与16S rRNA3末端的富含嘧啶的序列结合。前导序列（leading sequence)不同基因的SD序列不完全相同，从而控制翻译产物的数量,poly-cistron：即参与一个代谢途径的若干基因编码在同一个转录单位内，具有多个ORF。ORF：按照一定的阅读框，从起始密码到终止密码子可连续解读遗传密码的区域。阅读框：解读mRNA中遗传密码的三联体方式。,56,57,In Eukaryote,58,In Eukaryote,mono-cistron,59,6.4 核糖体的结构,在一个生长旺盛的细菌中，大约有2万个核糖体。其中蛋白质占细胞总蛋白的10，RNA占细胞总RNA的80 真核生物中核糖体的数量更多，蛋白质和RNA占细胞总蛋白质和总RNA相当大比例,60,核糖体的结构,61,62,核糖体:由几十种蛋白质和几种RNA组成的亚细胞颗粒，基本不含脂肪,核糖体的组装,所有核糖体蛋白都首先在细胞质中被合成，运转到细胞核内，在核仁中被装配成40S和60S核糖体亚基，然后运转到细胞质中行使作为蛋白质合成机器的功能,64,Ribosomes,70S(2.5M),80S(4.2M),50S(1.6M),30S(0.9M),60S(2.8M),40S(1.4M),5S rRNA(120 nt)23S rRNA(2900 nt)34 proteins,16S rRNA(1540 nt)21 proteins,5S rRNA(120 nt)28S rRNA(4700 nt)5.8S rRNA(160 nt)49 proteins,18S rRNA(1900 nt)33 proteins,Prokaryotes,Eukaryotes,65,Complete initiation Complex of translation,Translation domain,Exit domain menbrane,Exit site,5s site,转肽酶中心，形成肽键,P site,A site,EF-G site,EF-Tu site,mRNA site,20 Nt,肽基转移部位,结合或接受aatRNA部位,8个重要的功能域或位点：小亚基与mRNA的结合位点；大亚基与氨酰基tRNA结合的位点A；大亚基与肽链结合的位点P；空载tRNA离开核糖体的出口位点E；大亚基的肽基转移酶结构域；EF-Tu进入核糖体的位点；EF-G结合位点；大亚基与5S rRNA结合位点。,66,核糖体有两个结合携带氨基酸的tRNA 的位点,P位点：结合多肽链-tRNAA位点：氨酰-tRNA进入的位点,67,原核生物和真核生物的翻译过程分为三个阶段：起始（initiation）延伸（elongation）终止（termination）,6.4 原核生物的翻译过程,68,6.4.1 起始,IF-1 9.5kd 热稳定蛋白质，加强IF-2、IF-3的酶活IF-2 95kd-117kd 热不稳定蛋白质，促使fMet-tRNA fmet(起始tRNA)选择性的结合在30S亚基上IF-3 20kd 促使30S亚基结合于mRNA起始部位，稳定游离的30S亚基，使其不与50S亚 基结合成70S的颗粒,即核糖体的大小亚基、tRNA和mRNA在起始因子的协助下组合成70S起始复合物的过程,（1）起始因子(initiation factor，IF),IF并不牢固结合于核糖体，在起始复合物形成后就很快解离,69,(2)起始tRNA与起始密码子的识别,起始密码子为 AUG，细菌中有时也用GUG和UUG。但三种起始密码子的使用效率不同。用GUG代替AUG起始效率下降一半；用 UUG代替GUG起始效率又下降一半AUG和GUG作为起始密码子代表甲酰化甲硫氨酸；位于内部时AUG代表甲硫氨酸，GUG代表缬氨酸甲硫氨酸有两种tRNA，一种识别起始AUG，另一种识别延伸过程中的AUG在细菌和真核生物的细胞器，起始tRNA携带的是甲酰化的甲硫氨酸(fMet-tRNAf)。内部的AUG由Met-tRNA识别,70,(3)起始复合物与70S核糖体的形成,A.IF3促进70S亚基的解离，并与30S亚基结合。结合有IF3因子的30S亚基与mRNA结合,B.IF2结合于起始tRNA，然后IF2再与30S亚基结合，或者顺序颠倒。在IF2与起始tRNA形成的二元复合物结合于30S亚基后，GTP分子立即与30S亚基结合。,C.50S亚基结合上来，GTP水解，释放出的能量改变了30S亚基和50S亚基的构象，促进70S核糖体亚基的形成，同时释放出IF3和IF2因子。,71,6.4.2 肽链的延伸,肽链的延伸以氨酰基tRNA进入70S起始复合物（进位）的A位为标志，这一过程需要延伸因子(elongation factor，EF)参与 细菌中的延伸因子为EF-Tu(热不稳定)、EF-Ts(热稳定)、EF-G(又叫转位因子，依赖GTP),（1）延伸因子,EF-Tu只有在氨酰基tRNA进位时才能与核糖体结合，进位完成后从核糖体上解离下来，参与下一个进位过程，是一个典型的辅助因子,72,A.转肽与肽键的形成,EF-Tu首先与GTP结合，然后与氨酰基tRNA结合形成三元复合物，此三元复合物才能进入核糖体的A位。GTP的存在是氨酰基tRNA能够进入A位的先决条件之一，不需要GTP的水解,一旦进入A位后，GTP立即水解成GDP，EF-Tu、GDP二元复合物就与氨酰基tRNA解离而释放出来,(2)延伸过程,然后肽基转移酶把位于P位的甲酰甲硫氨酰基或肽基转移到A位的氨酰基tRNA的氨基上并形成第一个肽键或新的肽键,B.转位,肽键形成后，转位因子EF-G和GTP结合上来。核糖体中具有GTP酶活性的蛋白质将GTP水解，在A位生成的肽基tRNA转移到P位，同时将原来P位上空载的tRNA逐出核糖体，mRNA移动一个密码子，核糖体沿mRNA5 3方向移动，每次移动一个密码子的距离，同时一个新的密码子进入空的A位，EF-G 催化的移位过程需水解GTP提供能量。肽链合成从N-C。,转位后EF-G和GDP必须释放出来，下一个氨酰基tRNA的三元复合物才能进入A位,能使核糖体停在转位后的状态，因为它稳定了EF-G GDP与核糖体的复合物，使下一个氨基酸不能加到肽链上来,74,C.两类延伸因子的交替作用,只有EF-Tu离开核糖体后，EF-G和GTP才能结合上来；同样，只有EF-G离开核糖体后，新的氨酰基tRNA三元复合物才能进入A位,只有当P位点被肽基tRNA占据而A位点空着时，氨酰基tRNA三元复合物才能进入A位；只有当肽键生成后，肽基转移到A位的氨酰基tRNA上，P位tRNA空载，EF-G和GTP才能结合到核糖体上来,75,D.Ts循环,EF-Ts的作用：使用过的EF-Tu-GDP能够转变为有用的形式EF-Tu-GTP。,76,77,6.4.3 终止和肽链的释放,原核生物和真核生物都有三种终止密码子UAG(amber，琥珀密码子)、UAA(ochre，赭石密码子)、UGA(opal，乳石密码子)在细菌中，UAA使用频率最高，UGA次之，UAG最低没有一种tRNA能与终止密码子作用，而是由特殊的蛋白质因子促成终止作用，称为释放因子（releasing factor，RF）原核生物有三种释放因子：RF1（识别UAA和UAG）、RF2（识别UGA和UAA）、RF3（刺激RF1和RF2的活性）释放因子作用于A位点，并且需要P位被肽基tRNA占据，此过程需要肽基的转移以及空载tRNA逐出核糖体,78,79,tRNA和mRNA在核糖体中的移动,mRNA 和 tRNA 以相同的方向穿过核糖 体,80,6.5.1 合成起始,需要甲硫氨酰tRNA、ATP、GTP和十几种起始因子(eIF)参与,eIF2 3种亚基 形成三元起始复合体（eIF2,GTP,tRNA),eIF1 15kd 促使mRNA 与40S亚基结合eIF3 500kd 促使mRNA 与40S亚基结合eIF4b 80kd 促使mRNA 与40S亚基结合,eIF4a 50kd 促使与mRNA,GTP结合,eIF4C 19kd 促使两亚基结合,eIF5 150kd 释放eIF2,eIF3,eIF4e(eIF4f 的亚基)与5端帽子结合,起始因子,6.5 真核生物的翻译过程,81,真核生物的起始复合物40S小亚基不是在起始密码子AUG处形成，而是首先在mRNA的5末端形成，其识别信号是mRNA 5末端的帽子结构在帽子处形成的起始复合物沿着mRNA移动，在向下游移动过程中扫描翻译起始密码子前的信号，直到发现起始密码子AUG，60S亚基结合上来形成80S核糖体起始因子的作用细节大多不太清楚,82,Initiation of translation in Euk.,eIF-2,GTP,Subunit Initiation Complex,Subunit binding to end of mRNA,Triplex complex,1.GTP首先与eIF2结合，这一结合增加了eIF2与起始tRNA的亲和力，然后三者结合成一个三元复合物,3.40S亚基三元复合物在eIF3的存在下与mRNA结合，这一过程需要水解1分子ATP以提供能量,4.起始复合物沿着mRNA向起始密码子AUG移动以便形成80S核糖体,2.三元复合物直接与40S亚基结合，这一过程不需要mRNA的存在,83,6.5.2 肽链的延伸,肽链的延伸是将mRNA的核苷酸序列翻译为多肽链的氨基酸序列的过程，其中翻译的准确性是该过程的关键,（1）延伸因子 真核生物中普遍存在的是eEF1和eEF2，在真菌中还有eEF3eEF1：多聚蛋白质，主要负责氨酰基tRNA转运至核糖体。大多数生物中由4种不同的亚基组成，分别为、和 eEF2：是单体蛋白质分子，能与GTP结合，GTP是eIF2发挥功能所必需。eIF2参与移位，具有GTP酶活性eEF3：在酿酒酵母、白色念珠菌和裂殖酵母中发现，由一条多肽链组成，具有结合和水解ATP和GTP的能力，功能还不清楚,84,（2）延伸循环,与原核生物相似，分为进位、肽键形成和移位三个阶段。,进位：是指aa-tRNA进入A位。aa-tRNA是以eEF-1-GTP-aa-tRNA复合物的形式进入A位，并需要GTP的水解，在此过程中，如何保证正确aa-tRNA的进入即翻译的准确性是一关键问题肽键形成：aa-tRNA进位后立即形成肽键。肽键形成是在大亚基的肽基转移酶中心的催化下完成的移位：过程还不了解。移位需要eEF2参与。,85,（3）合成终止,合成终止是在终止因子的作用下肽链停止延伸及核糖体与mRNA分离的过程。,终止因子只有一种为eRF，能识别三种终止密码子UAA、UAG和UGA,终止的机制：当核糖体移动到终止密码子处时，由于没有氨酰基tRNA能对其识别，核糖体将在此处暂停，eRF因子可以识别终止密码子，并与核糖体形成复合物，引起肽链的释放，在核糖体释放因子(ribosome releasing factor)的共同作用下，核糖体与mRNA解离，肽链延伸终止。,86,6.6 翻译初始产物的后加工,由核糖体释放的新生肽链并不是一个完整的、有生物学功能的蛋白质分子，必须经过后加工，才具有生物学活性，包括形成高级结构、与其他亚基缔合及其他的共价修饰。,6.6.1 肽链中氨基酸残基的化学修饰,肽链中氨基酸残基的化学修饰是翻译后处理的重要内容，反应的主要类型有以下几种：,87,88,乙酰化：主要发生在N末端的氨基和赖氨酸的氨基上甲基化：发生在氨基、氨基、精氨酸的胍基和C末端的羧基和侧链的羧基上磷酸化：主要发生在丝氨酸的羟基和苏氨酸及酪氨酸的羟基上泛酸化：发生在氨基和氨基上转氨基酸作用：主要发生在N末端的氨基上多聚ADP核糖基化：主要发生在精氨酸的胍基上糖基化：可以通过N糖苷键连接于天冬氨酰的酰氨基上，也可以通过O糖苷键连接于丝氨酸和苏氨酸的羟基上以及羟赖氨酸和羟富氨酸的羟基上，也可以通过S糖苷键连接于半胱氨酸的巯基上,89,6.6.2 肽链N端甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸的除去,成熟的蛋白质末端大部分不是甲硫氨酸，故必须切去N端的一个或几个氨基酸。甲酰基由脱甲酰酶催化去除。,6.6.3 信号肽的切除,无论原核生物还是真核生物，蛋白质除游离于胞浆内发挥作用外，还有一部分要分泌到细胞外和定位于膜系统中起作用 如革兰氏阴性菌的细胞膜具有两层膜结构，内膜含有与能量代谢和物质转运有关的蛋白质；外膜有促进离子和营养物质进入细胞的蛋白质，膜周质中含有水解酶及其他蛋白质,90,真核生物细胞更加复杂，细胞内有各种不同的细胞器，每种细胞器又有不同的膜结构。蛋白质在细胞内的定位更加复杂 蛋白质不但要决定是否越膜，还要决定要越膜的种类。在越膜过程中，有时要在翻译的同时发生一些处理过程（cotranslational processing），而翻译后发生的共价修饰称为翻译后加工（post translational processing）,91,6.6.4 肽链的折叠,肽链的折叠在肽链合成没有结束时就已经开始。核糖体可保护30至40个氨基酸残基长的肽链，当肽链从核糖体中露出后，便开始折叠三级结构的形成几乎和肽链合成的终止同时完成。例如，大肠杆菌半乳糖苷酶的抗体可识别酶的三级结构，能与合成该酶的多核糖体结合。该酶的活性形式为四聚体，当新生的肽链还未由核糖体释放时，就能与游离的酶分子形成活性形式。说明高级结构的形成在合成终止前就开始了。由此可见，蛋白质的折叠是从N端开始的,92,6.6.5 切除前体中功能不必需肽段,6.6.6 二硫键的形成,在蛋白质的前体分子中，有一些肽段是功能所不需要的，在成熟的分子中不存在。肽段的切除是在专一性的蛋白水解酶的作用下完成的。如前胰岛素原的加工过程中去除了分子内部的连接肽(C肽)。多种多肽激素和酶的前体大都要经过这一加工过程。,在mRNA分子中，没有胱氨酸的密码子，而不少蛋白质分子中含有胱氨酸二硫键，有的还有多个，且二硫键是蛋白质的功能基团。二硫键是通过两个半胱氨酸的巯基氧化形成的，有的在切除肽段前就已形成。,93,6.6.7 多肽链N端和 C端的修饰,在少数情况下，合成的多肽一端或两端存在修饰氨基酸，如微管蛋白的链在酶的作用下C端能被酪氨酸修饰，且不需要tRNA。还发现一种能从活化的tRNA上将氨基酸残基转移到成熟的蛋白质N端上。哺乳动物中也有类似的现象，意义不详。在病毒和细菌中，有些蛋白质N端氨基被乙酰化；在真核生物中，细胞中有半数以上的蛋白质N端被乙酰化 乙酰化受N乙酰转移酶催化，该酶对N端氨基酸有选择性，能被修饰的有：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和天冬氨酸。可能具有调解蛋白质稳定性的作用 多数多肽的C端被酰胺化，特别是多肽激素，如催产素、加压素、促胃液素、缩胆囊素和分泌素。酰胺化能保护多肽免受外切酶的水解 另外N端还有葡萄糖胺和脂肪酸基团的修饰等,6.7 蛋白质运转机制,在生物体内，蛋白质的合成位点与功能位点常常被一层或多层细胞膜所隔开，这样就产生了蛋白质运转的问题。真核生物细胞内，几乎在任何时候，都有数以百计或千计的蛋白质离开核糖体并被输送到细胞质、细胞核、线粒体、内质网和溶酶体、叶绿体等各个部分，补充和更新细胞功能。由于细胞各部分都有特定的蛋白质组分，因此合成的蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。,95,In Prok.-核糖体附着在细胞内膜（inner membrane）,蛋白质合成方式,游离型与分泌型合成蛋白质的核糖体 在结构与功能上没有差别,蛋白质运转可分为两大类：翻译运转同步机制和翻译后运转机制分泌蛋白质大多是以翻译-运转同步机制运输的。在细胞器发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。而参与生物膜形成的蛋白质，则依赖于上述两种不同的运转机制镶入膜内,跨膜运输和镶入膜内的几种主要蛋白质,97,细胞溶质,分泌泡,溶酶体,98,6.7.1 翻译-运转同步机制 蛋白质分泌的信号肽假说,分泌蛋白是一类典型的翻译和转运同步进行的蛋白质分泌是蛋白质从细胞内部释放到胞外空间的过程一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达，这就是信号肽假说的基础,信号肽假说认为，蛋白质跨膜运转信号也是由mRNA编码的。在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，这个氨基酸序列被称为信号肽。信号肽合成后便与膜上特定受体相互作用，带正电的信号肽与带负电荷的磷脂膜作用，引导蛋白质进入内膜，产生通道，允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构，因此，这种方式是边翻译边跨膜运转。,100,signal S.的基本结构,101,signal Seq.引导的穿膜机制,-signal S.带正电的区段与带负电的磷脂膜互作,引导蛋白质进入 inner M.,102,-疏水区段嵌入磷脂膜内或形成helix,-并对磷脂双层膜产生扰动效应，-诱发形成非脂双层结构，以保证Signal S.所牵引的蛋白质顺利穿膜,103,104,真核生物细胞质中合成的蛋白质如何到达不同的部位取决于蛋白质是否具有转运信号如果没有转运信号，蛋白质就保留在细胞质中。不同的细胞定位需要不同的转运信号细胞表面蛋白、分泌蛋白和溶酶体蛋白（统称为分泌蛋白）具有与原核生物相似的信号肽。真核生物的信号肽也能形成螺旋的发夹结构，在信号肽识别颗粒(signal recognition particle，SRP)协助下插入到糙面内质网膜中新生肽向内质网内腔运转过程中，SRP和DP(docking protein又称SRP受体蛋白)介导蛋白质的跨膜运转过程,真核细胞分泌蛋白穿膜的分子模式,105,绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽，该序列常位于蛋白质的氨基末端，长度一般在13-36个残基之间，有3个特点：（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）。,106,SRP是一个RNA和蛋白质组成的复合物，由 7 SL RNA和 6种蛋白质组成。其中，7 SL RNA由 300个核苷酸组成SRP有两个结构域，一个是信号肽识别结构域，由7 SL RNA中的100至250个核苷酸与 19、54、68和 72 kDa蛋白质构成，另一个由7 SL RNA的其他部分与9和14 kDa蛋白质组成，使肽链延伸暂停，叫做延伸作用制动结构域，即当SRP与DP结合后，多肽合成恢复,SRP能同时识别正在合成需要通过内质网膜进行运转的新生肽和结合核糖体，SRP与信号肽结合是多肽正确运转的前提，但同时也导致了该多肽合成的暂时终止（此时新生肽一般长约70个残基左右）。SRP-信号肽-核糖体复合物即被引向内质网膜并与SRP的受体DP相结合。SRP与DP结合后，多肽合成恢复。信号肽通过膜上的核糖体受体及蛋白运转复合物跨膜进入内质网内腔，新生肽链重新开始延伸。,109,整个蛋白跨膜以后，信号肽被水解，形成高级结构和成熟型蛋白质，并被运送到相应细胞器。SRP与DP的结合很可能导致受体聚集而形成膜孔道，使信号肽及与其相连的新生肽得以通过。此时，GTP 放能，SRP与DP分离并恢复游离状态。待翻译过程结束后，核糖体的大、小亚基解离，受体解聚，通道消失，内质网膜也恢复完整的脂双层结构。进入内质网内腔后，蛋白质常以运转载体的形式被送入高尔基体或形成运转小泡，分别运送到各自的亚细胞位点。,110,蛋白质主要在RER核糖体上合成，新合成的肽链首先进入内质网腔，然后被包被于膜囊中进行运送。蛋白质的去向由特异信号决定，该信号来源于蛋白质上的一段短的、共价修饰的氨基酸序列，称为前导肽蛋白质包裹于由内质网形成的小膜泡（vesicle）中，可溶性蛋白在膜泡空腔中运输，跨膜蛋白通过结合在膜上而被运输蛋白质从内质网通过膜泡转移到高尔基复合体 细胞内部内膜系统各个部分之间的物质传递常常通过膜泡运输方式进行。如从内质网到高尔基体；高尔基体到溶酶体；细胞分泌物的外排，都要通过过渡性小泡进行转运,翻译后运转机制,1