分子生物学第五章分子生物学研究法.ppt

第五章 分子生物学研究方法,1、重组DNA技术发展史上的重大事件2、DNA操作技术3、RNA基本操作技术4、核苷酸序列分析,分子生物学从20世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。,基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。,基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。,跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。,本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等3个环节。,51 重组DNA技术史上的重大事件,半个世纪以来，分子生物学研究主要取得了3大成就:第一 解决了遗传的物质基础问题 基因的分子载体是DNA;,51 重组DNA技术史上的重大事件,第二 DNA分子的双螺旋结构模型和半保 留复制机制，解决了基因的自我 复制和世代交替问题;,51 重组DNA技术史上的重大事件,第三“中心法则”和操纵子学说，成 功地破译了遗传密码，阐明了 遗传信息的流动与表达机制。,DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。,重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。,限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoR I能特异识别GAAUC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。,EcoR l酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。,目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。,52 DNA基本操作技术 521 核酸凝胶电泳技术,1.基本原理 生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。,521 核酸的凝胶电泳,1.基本原理 分子在电场作用下的迁移速度与电场强度和电泳分子所带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。,521 核酸的凝胶电泳,1.基本原理 根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。,DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子(磷酸基团)，在电场中会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。,2.琼脂糖凝胶电泳,化学修饰的低熔点琼脂糖(线性多糖聚合物)，在较低温度下便会熔化，冷却凝固便形成良好的电泳介质。常用于DNA片段的电泳制备。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50kb之间;而聚丙烯酰胺凝胶(SDS)分辨范围为1-1000bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,如20%的SDS凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而分离1000bp的DNA片段则用3%的SDS凝胶。再如2%琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%-1.0%)的琼脂糖凝胶。脉冲电场凝胶电泳（PFGE)可分离50Kb的DNA小片段,溴化乙锭(EB)能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间(图5-4)，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光,荧光强度与DNA片段的数量成正比(可检测到0.05g的DNA)。把EB直接加到凝胶介质中或电泳后染色。,细菌转化：细菌菌株由于捕获了外源DNA导致性状特征发生遗传改变的生命过程。大肠杆菌是分子生物学家常用的实验材料，也是基因工程重要的实验菌株。,5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖,5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖,供体菌株、受体菌株、感受态细胞、阳性克隆细菌转化方法 CaCl2法、电击法（电脉冲）、体外包装法（噬菌体）,大肠杆菌低温(0)预处理的低渗氯化钙溶液中，外源DNA粘附在细胞表面，立即将其转到42下做短暂的热刺激，外源DNA被细胞所吸收（感受态）。,5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖,523 基因扩增,聚合酶链式反应即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。,PCR技术的原理,先将双链DNA分子加热分离成单链，单链DNA模板种dNTP DNA聚合酶新生的DNA互补链。新合成的DNA链的起点，由加入到反应体系中的一对引物决定的。,PCR反应的全过程,反应包括DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。,待扩增DNA样品94 1min 变性(解链)56 1min 退火(引物结合靶DNA区段)72 1至数分钟延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,【开发史】这项技术的发明人是Kary Mullis。1983年，在一家生物高技术公司（Cetus）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州101号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法，即PCR。,在1985年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。,Cetus给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年分子生物学领域最重要的一项技术突破。1993年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。,(1)PCR技术简史,PCR的最早设想,核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。,引物酶,引物酶,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA的变性与复性,DNA的变性与复性,DNA的变性与复性,PCR的实现,1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行易发生碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。,PCR的改进与完善,1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。,PCR的改进与完善,1988年，Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。具有以下特点：耐高温。热变性不被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高扩增片段特异性和扩增效率，增加扩增长度(2.0Kb)。,此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。具有较高的特异性、灵敏性和效率，此酶的发现使PCR广泛的被应用。,PCR即在体外模拟DNA复制的过程，加热变性使DNA变成单链，人工合成2个引物让它们结合到DNA模板的两端，DNA聚合酶即可以大量复制该模板。,（2）PCR技术的基本原理,假定我们要研究的DNA双链两端的序列是：TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA,PCR前先人工合成两段有20-30碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，把这两段引物和DNA模板、DNA聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合在一起，我们就可以开始做PCR了。,第一步模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,第二步模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,第三步引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。,每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR反应,（3）PCR的反应体系与反应条件,标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200mol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul,PCR的基本原理PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+,引物：PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,循环次数:循环次数决定了PCR的扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,酶及其浓度目前有种Taq DNA聚合酶，催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100u时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M TrisHCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。,在PCR反应中，dNTP应为50-200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。,SDS主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；,蛋白酶K能水解蛋白质，特别是组蛋白，再用有机酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。,Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，PCR反应中各dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0mmol/L为宜。,Mg2+浓度Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR的基本原理,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,电泳分析,PCR设备,电泳分析,（5）PCR的应用,在分子生物学基础研究上，被广泛地用于基因克隆和制造突变。研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他,在临床医学上，PCR被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。用传统的方法，要检测病毒、病菌的感染需要把病原体培养数周才能鉴定，而现在用PCR，即可以迅速判断人体细胞（比如血液细胞）中是否存在病毒、病菌的DNA（比如HIV的DNA）而确诊。,在法医上，PCR目前已成为发现罪证的重要方法。比如，0.1微升的唾液痕迹所含的DNA就可以通过PCR扩增而获得足够量的DNA进行测序鉴定罪犯。毛发、血迹、唾沫、精液因此都可以成为重要的罪证。,利用PCR技术，科学家们已从林肯的头发和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千万年前的昆虫、恐龙的骨头等不寻常的样品中提取了足够的DNA进行研究。博物馆中的化石标本都有可能成为遗传学的研究对象，一门分子古生物学因此诞生。,PCR技术在法医学中应用,5.2.4 实时定量PCR 1.SYBR Green I探针(1种荧光）2.Taq Man探针(2种荧光，短波长和长波长）,5.2.4 实时定量PCR 1.随着新合成目的DNA片段的增加，结合到 DNA上的荧光探针被激发的荧光相应增加。2.Taq Man探针三要素：短波长荧光基团 目的DNA特异的碱基序列 长波长荧光基团,5.3 RNA基本操作技术,（1）高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的吸附物，用磁场吸附与PMP相连的Oligo(dT)-mRNA。,5.3 RNA基本操作技术,（2）反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶。应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA的方向性。,54 核苷酸序列分析,仪器分析发展很快。如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。下面介绍测序的基本原理。,54 核苷酸序列分析,Sanger双脱氧链终止法利用聚合酶能够利用双脱氧核苷三磷酸作底物掺入到核苷酸链中而终止链的生长（双脱氧核苷三磷酸没有基团）。,54 核苷酸序列分析,Maxam-Gilbert化学修饰法硫酸二甲酯、肼、六氢吡啶放射标记片段碱基特异性切割不同长度片段凝胶电泳和放射自显影读出序列。,54 核苷酸序列分析,序列分析自动化四甲基若丹明作荧光剂。激光计算机自动分析,54 核苷酸序列分析,杂交测序法（）寡核苷酸探针靶完全双链杂交分子比较分析推断靶序列,54 核苷酸序列分析,杂交测序法（）,