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分子生物学常用技术,凝胶电泳,分子杂交技术,PCR 技术,DNA 物理图谱 DNA序列测定 生物芯片,“基因靶向”技术,RNA干扰技术,分子杂交技术,核酸分子杂交 是在DNA变性和复性的基础上建立起来的一种分子 生物学技术.其原理是具有一定同源性的两条核 酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形 成双链(碱基对之间非共价健形成稳定的双链).,杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有 相近的化学性质(或结构互补)而在适宜的 条件下特异地相互识别、结合形成杂交体（hybrid）的过程。,（一）DNA变性 DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成 单链无规则线团样DNA，称为DNA变性。变性方法：1):加热、2):DNA溶液的pH改变、3):有机溶剂等 变性的DNA的特征：粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加。（二）DNA复性 变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结 合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性 后的DNA，理化性质都能得到恢复。,核酸分子杂交的特点:高度特异性 高度灵敏性已成为分子生物学中最常用的基本技术.广泛应用于:基因克隆的筛选 酶切图谱的制作 基因序列的定量和定性分析 基因突变的检测等。,杂交的双方:待测核酸序列+探针（probe）待测核酸序列:克隆的DNA片段 未克隆化的基因组DNA 细胞总RNA,mRNA。,核酸分子杂交,核酸探针：是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记而便于检测的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。基因组DNA探针 cDNA探针 寡核苷酸探针 RNA探针等,探 针,1、DNA探针DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针种类很多:有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。,来源:分子克隆 PCR,、cDNA 探针 cDNA（complementary DNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。无内含子和非编码序列 cDNA 探针是目前应用最为广泛理想的一种探针。,来源:分子克隆 RT-PCR,DNA探针（包括cDNA探针）的优点：:这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖、大量制备、方法简便。:不易降解（相对RNA而言），DNA酶活性一般能有效抑制。:DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。,3、RNA探针：RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高,特异性强。克隆载体体外转录(in vitro transcription)RNA探针 容易降解,4、寡核苷酸探针：根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选和点突变分析。人工合成的寡核酸探针有下述优点：短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。可以在短时间内大量制备。在合成中进行标记制成探针。可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。,人工合成的寡核酸探针有下述优点：短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。可以在短时间内大量制备。在合成中进行标记制成探针。可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。,筛选寡核苷酸针的原则：长1850bp，较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。碱基成分：G+C含量为40%60%，超出此范围则会增加非特异杂交。探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸文库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。,克隆探针：前述三种探针(DNA,cDNA,RNA)均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。克隆探针的优点：（1）:特异性强，从统计学角度而言，较长的序列复杂度高，随机碰撞互补序列的机会较短序列少；（2）:可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基团更多。,核酸探针的标记,核酸探针的制备是分子杂交技术的关键,放射性同位素标记:敏感度高 辐射危害 最早采用,最常用的核酸探针标记方法。常用同位素:32P、35S。32P因其能量高，信号强，所以最常用。半衰期:32P为14.3天、35S为87.1天、125I为60天、3H为12.3年,核酸探针的常用酶促标记技术有：缺口平移 DNA快速末端标记 用T4多核苷酸酶标记DNA 5末端 随引物延伸 聚合酶链反应,缺口平移,DNA快速末端标记；3 末端,随引物延伸,非放射性标记物有下述几类：金属如Hg荧光物质如F2TC半抗原如地高辛、生物素酶类如辣根过氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AKP）等不同的标记物，所标记探针的方法及检测方法也各异。,固相杂交:将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。优点:1):未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，2):膜上留下的杂交物容易检测,3):能防止靶DNA自我复性等。常用类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。液相杂交:参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）等,核酸分子杂交方法,Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建DNA+DNA杂交:即将待测DNA酶切、电泳、转移（印）并固定在固相支持物上，用已知DNA探针进行检测的方法。,用途：1):基因定性定量 2):DNA物理图谱 3):基因变异重排 4):基因限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RFLP）5):疾病诊断,探针:DNA探针,Southern印迹杂交,Southern 杂交(Southern blotting)的主要步骤,待测DNA样品的制备、酶切待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备 Southern杂交杂交结果的检测,1DNA的变性解链:数倍体积的1.5mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH中1小时2.中和:然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl（pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小时3转移:变性DNA在硝酸纤维素膜,尼龙膜上的固定。硝酸纤维素滤膜（孔径0.45um）用6SSC浸泡30min，DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，然后再在80真空干燥2h or UV cross link。4预杂交:预热至60的预杂交液（6SSC，0.5%SDS，5Denhardt液，100g/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，调浓度至10g/ml，用前放100水溶液中煮沸变性10min，,Southern转膜变性杂交:,5杂交:尽可能挤净预杂交液，溶液的组成是6SSC，0.01mol/L EDTA，变性的标记核酸探针，5Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml变性的鲑鱼精DNA。杂交反应在68水浴中进行，时间一般为4-20h。6洗膜:2SSC和0.5%SDS溶液室温下漂洗5min,2SSC和0.1%SDS中,室温下洗涤15分钟(轻轻摇动),0.1%SSC和0.5%SDS溶液中,68轻轻摇动保温2h，洗脱的温度一般应控制在Tm值12以下，Tm=69.3+0.41(G+C）%。7结果显示:放射自显影法，只需将杂交膜与X光片在暗盒中暴光数小时至数天，再显影，定影即可.暴光通常在-20或-80,Phosphorimage定量,转移缓冲液,121204 cell clones DNA digested with EcoRI,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 m 11 12 13 14 15 16 17 18 19,1:12:33:124:385:406:417:568:639:6510:67M:1kb marker11:7412:7513:7614:7715:7816:9517:9818:10119:235,Assay the copy number of provirus in HT1080 with Southern blot,19 18 17 16 15 14 13 12 11 M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1,1:12:33:124:385:406:417:568:639:6510:67M:1kb ladder11:7412:7513:7614:7715:7816:9517:9818:10119:235,121004 cell clones DNA digested with EcoRI,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 m 11 12 13 14 15 16 17 18 19,1:542:963:974:2245:2316:2327:2338;235/nondigested9:23610:239M:1kb ladder11:24012:24413:24514:24815:25216:28617:29018:30119:313,Assay the copy number of provirus in HT1080 with Southern blot,19 18 17 16 15 14 13 12 11 M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1,1:542:963:974:2245:2316:2327:2338;235/undigested9:23610:239M:1kb marker11:24012:24413:24514:24815:25216:28617:29018:30119:313,Northern印迹杂交（Northern blotting）,这是一种将待测RNA从琼脂糖凝胶中转印并固定到膜上、然后再与已知的DNA或RNA探针杂交的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交。,Northern 印迹杂交的RNA转移与Southern印迹杂交的DNA转移方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。,RNA+DNA/RNA杂交,用途：1):基因表达(mRNA)定性定量 2):transcripts(mRNA)splicing,探针:DNA、RNA 探针,Northern印迹杂交,Northern blotting,RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法 1.试剂：10MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。5载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。20SSC；去离子甲酰胺；50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)；0.1mol/L Tris，pH7.5。,2.电泳步骤：（1）40ml水中加0.7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60，加7ml10MSE缓冲液,11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。（2）等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1MSE缓冲液的电泳槽。（3）使RNA变性（最多20g），RNA4.5ul,10MSE缓冲液2ul，甲醛3.5ul，去离子甲酰胺10ul。（4）55加热15min，冰浴冷却。（5）加2ul5载样缓冲液。,（6）上样、同时加RNA marker/ladder。（7）60伏电泳过夜。（8）取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。（9）将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。（10）将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。（11）20SSC洗胶1h。（12）20SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。（13）取出硝酸纤维素膜，80真空烘烤2 h,Northern blot 与Southern blot 相似,转移方法与杂交程序:,042506A RNA gelling for single copy HT1080 clones,M 1080 24 96 107 115 206 228 241 243,M 1080 24 96 107 115 206 228 241 243,28S,18S,RNA splicing,核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay，RPA）是一种高通量，各项指标均优于传统Northern Bloting的mRNA定量检测技术。利用32P-（放射法）或生物素（非放法）标记由多个目标基因的DNA模板体外转录出的长短不一的反义RNA探针，将含过量探针的溶液与样品总RNA杂交，经核糖核酸酶（RNase）处理后，未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解，而目标RNA则因与探针结合形成双链而被保护，则杂交双链RNA的量代表了样本中相应基因的表达量。,核糖核酸酶保护分析,液相杂交,信号检测：对于放射性RPA，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号。对于非放的RPA，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，UV照射使被保护的RNA探针与膜交联而固定，再用试剂盒提供的链霉亲和素辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，这样，再将膜放入暗盒中暴露于X射线胶片或者用CCD照相机检测杂交探针的信号。根据适当大小的探针片断的信号强度来定量待测样本中该探针RNA代表的基因表达水平。,放射性RPA,放射性非放的RPA,凝胶真空干胶器,用于电泳后凝胶的干燥干燥时间：20-40min,RPA vs Northern Blot 之优势：1):过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 2):RPA比Northern Blot灵敏15150倍，适合检测 各种表达水平之基因 3):RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在 同一情况下的差异表达 4):快速,一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度,1菌落原位杂交（colony in situ hybridization）是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。,实验步骤如下：Master plate:将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素 的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种 于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板 上菌落位置相同。培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉 多余液体，将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸 上，菌落面在上，注意防止滤膜底面存有气泡。,Master plate,5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。将滤膜转至中和溶液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L Tris-HCl pH8.0)浸湿的滤纸上，放置10min，重复中和一次。将滤膜移至用2SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min，SSPE配成20贮备液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。将滤膜用滤纸吸干，80真空烘干2h。,菌落原位杂交,菌落原位杂交,斑点杂交:是将被检DNA/RNA点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如Minifold和、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。膜烤干或紫外线照射以固定标本。,2斑点杂交（Dot blot）。,（1）DNA斑点杂交：先将膜在水中浸湿，再放到15SSC中。将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,5l(210g DNA)。将膜烘干，密封保存备用。（2）RNA斑点杂交：每个样品至多加10g总RNA溶于5l DEPC水，加 5l甲醛/SSC缓冲液（10SSC中含6.15mol/L甲 醛），使RNA变性，然后取5-8l点样于处理好的滤膜 上，烘干。,5组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。,原位杂交的探针:单链或双链DNA，RNA。长度:100-400nt，过长则杂交率减低。寡核苷酸探针（16-30 nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针.寡核苷酸探针,小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交优选探针。,原位杂交程序:,组织细胞的固定 预杂交 杂交 冲洗 放射自显影/免疫酶法显色以显示杂交结果,原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。1):对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示按规定序列的位置，对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；2):与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，3):原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向 4):病原微生物存在方式和部位。,组织原位杂交用途：定位,定量,Western blot,原理:Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,斯坦福大学的乔治斯塔克（George Stark）。在尼尔伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的分析生物化学（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。,蛋白质,抗体,酶或同位素标记的第二抗体,底物显色或放射自显影,+,+,分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。,电泳印迹,电泳转移即电泳印迹。它是利用低电压，大电流的直流电场使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上。,电泳槽,适用于将凝胶电泳的图谱转移到固相转移膜上DF-9夹芯电泳槽 可做各种凝胶电泳,DF-13A转移电泳槽,转移电泳槽,Thanks!,