分子生物学五年制用.ppt

Molecular Biology of Carcinomas,康英姿天津医科大学生物化学教研室,多细胞生物体从古至今共同的危难,一个离经叛道、恣意妄为的细胞在人体的某个组织内开始了自己独特的生长道路。自此以后，是它自身内部的程序而不再是周围细胞群体的需要决定着它的扩张行径。所以不是几百万个新生力量，而是一个始作俑者，产生了数目巨大、一脉相承的叛乱后裔。肿瘤中那几十亿个细胞同它们叛逆的祖先如出一辙，它们对于周围组织的健康成长毫无兴趣，同它们的先祖一样，它们抱定一个宗旨：快快成长，快快分裂，无限扩张。,细胞行为改变的历程-细胞的转化,真核细胞有固有寿命（life span），所有高等真核生物的一个重要特征是机体有他自己独特的生命期限，而落实到每一个细胞，则是真核细胞的生长和分裂都受到高度的调节；主要特征是具有固定寿命。一个成熟组织维持正常构造的能力取决于前赴后继的机制；在大多数成熟组织内部细胞不断地更新着，即由大量候补者的生长来补偿前任细胞的偶尔缺失。如果候补者过少，组织会枯萎衰竭；如果候补者过多，组织又会扩张出正常界限。,细胞增殖相关基础知识,Cells and macromolecules Protein structure Prokaryotic and eukaryotic chromosome structure DNA replication DNA damage,repair and recombination Gene manipulation Cloning vectors Gene libraries and screening Analysis and uses of cloned DNA,Transcription in prokaryotes Regulation of transcription in prokaryotes Transcription eukaryotes Regulation of transcription in eukaryotesRNA processing and RNPs（ribonucleoproteins）The genetic code and tRNAProtein synthesis Bacteriophages and eukaryotic viruses,Cells and macromolecules,Nucleus,Eukaryotic chromosome structure,DNA damage,repair and recombination,DNA损伤的因素DNA损伤的形式DNA损伤的修复光修复（light repair）切除修复（base-excision repair）重组修复（recombination repair）核苷酸切除修复（nucleotide-excisino repair）双链开链修复（double-strand beak repair of DNA）SOS修复（SOS repair）,DNA损伤的修复,DNA损伤和修复是细胞内DNA分子上同时并存的两个过程，以达到遗传保守性和变异性的统一。修复（DNA repairing）是指针对已发生了的缺陷而实施的补救机制。原核细胞的DNA损伤修复机制真核细胞的DNA损伤修复机制,DNA损伤及修复的结果,突变（mutation）是指一个或多个脱氧核糖核苷酸的结构、复制或表型功能的异常变化，即DNA损伤。自发突变（spontandous mutation）：是指自然界中自发出现的突变，属于遗传物质在复制过程中随机发生的误差。发生率为10-7至10-6。诱发突变（induced mutation）：指遗传物质在环境因素诱发下发生的改变。诱发因素包括：物理因素，紫外线、X射线、射线；化学因素，芳香胺类、多环芳烃类、亚硝基化合物、生物毒素、无机化合物及各种药物。生物因素，致癌病毒的感染。,突变的意义,突变与遗传的保守性是对立而又统一的自然现象突变是进化、分化的分子基础：没有突变就不会有遗传学，就不可能有现今五彩缤纷的生物世界。我们无法看到一个物种的自然演变过程，但能看到长时期突变积累的结果。突变造成了基因多态性（polymopism），由于遗传密码的漂移性，有些突变造成密码子第三位碱基的改变，而没有氨基酸的改变；或者突变发生在蛋白质的非功能区段上，氨基酸的改变不影响蛋白质的功能。,突变的意义,致死性突变：有些突变发生在对生命过程至关重要的基因上，可以导致个体、细胞的死亡。这些突变没有可遗传性。突变是某些疾病的发病基础：与基因突变有关的疾病有各种遗传性疾病（单机因疾病），肿瘤及有遗传倾向的疾病（多基因疾病）。疾病中的1/3以上属于遗传性病或有遗传倾向的疾病。常见的有遗传倾向的疾病有高血压、糖尿病、溃疡病及肿瘤等。随着医学研究的发展，使我们逐渐认识到，对某些疾病的易感性就来源于个体的遗传背景（backgroud）。,原代细胞（primary cell）,成熟细胞分裂能力有限-临界点（crisis）适度控制细胞的扩张是非常重要的。在任何时候，人体中的绝大多数细胞都处于静止状态。只有在不断更新的组织如结肠上皮、骨髓和皮肤等处，才能看到大量生长和分裂的细胞。把正常组织细胞取出作离体培养，由于生存空间的改变，细胞能够进行数代分裂；然后进入静止期，在经过一段时间后，培养细胞逐渐枯萎死亡。,稳定的细胞系,稳定的细胞系（established cell line）又叫永生化（immortalization）细胞。越过临界点的细胞（bypass crisis cell）的特征：（1）贴壁依赖性（anchorage dependence）（2）血清或生长因子依赖性（serum or growth factor dependence）（3）接触抑制作用（contact inhibition）（4）细胞骨架（cytoskeleton）结构变化,转化细胞系,转化细胞系（transformed cell）的特征：（1）失去了真核细胞系所表现的性状，失去了对血清及生长因子的依赖；（2）失去了贴壁依赖性和接触抑制作用，当相邻的细胞彼此接触时，仍继续生长，彼此发生重叠，堆积成细胞灶（focus）（3）在裸鼠体内可以长成肿瘤；（4）细胞性状可以稳定遗传。,肿瘤细胞系,在体外，原代细胞稳定的细胞系转化细胞，其发展过程伴随着基因调控、细胞生长周期的调控和信号传导等变化。在体内，肿瘤细胞的发生经历更为复杂的过程，还可又进一步的变化，它们可逃逸起源组织的限制，获得侵袭其他正常组织的能力，转移并建立新的肿瘤集落。在体内肿瘤细胞相对于正常细胞有三个特征：生长控制的减弱或无限制；局部组织浸润；蔓延或转移到身体的其他部位。,在人类基因组中，有一类基因的功能与细胞增殖、分化有关；他们的结构或功能的异常可能导致细胞增殖、分化异常，从而引起包括肿瘤在内的多种疾病。这类基因就是“癌基因”（负责正性调控），与“抑癌基因”（负责负性调控）。他们是细胞生长调控基因，是一组正常功能基因。,细胞转化的分子机制-基因表达结果异常,基因,基因的概念遗传的基本单位或单元，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位。是负载特定遗传信息的DNA分子片断；与mRNA相互补的DNA称为编码序列。基因的结构结构基因和调节基因*任何一个遗传单位或基因都有自己的结构基因和调节基因；因此，分别称之为转录序列和调节序列可能更恰当。,基因组,基因组（genome）就是来自一个遗传体系的一整套遗传信息。对原核细胞和噬菌体而言，它们的基因组就是单个的环状染色体所含的全部基因；对真核生物而言，一个基因组就是一个生物体的染色体所含的全部DNA，通常又称染色体基因组。,人类基因组计划,Human genome project,HGP:人类基因组计划完成的人类基因组草图是6个国家的20个实验中心10多年成果的顶点。个体的基因组就是个体的遗传组成。是个体从父母那里遗传得到的信息，部分地指导个体的生命过程。人类的基因组由30亿个数据，以脱氧核糖核酸（DNA）的形式组成。每个数据称为核苷酸或碱基，既DNA的组成单位。,基因表达,不同的生物基因组所含基因多少不同，在某一特定时期，基因组中只有一部分基因处于表达状态；且不同时期基因组的表达是有差异的。例如，与蛋白质生物合成有关的编码延长因子的基因表达活跃，与DNA损伤修复有关的酶分子的编码基因却极少表达；当有紫外线照射引起DNA损伤时，这些修复酶的编码基因表达异常活跃。,基因表达的时间性及空间性,基因表达具有严格的规律性；生物物种愈高级，基因表达规律愈复杂、愈精细，这是生物进化的需要及适应环境的需要。基因表达的时间、空间特异性由特异基因的启动子和增强子与调节蛋白相互作用决定。时间特异性（temporal specificity）按功能需要，某一特定基因的表达严格按一定的时间顺序发生，即基因表达的时间特异性。空间特异性（spatial specificity）在个体生长、发育全过程，一种基因产物在个体的不同组织或器官表达，即在个体的不同空间出现，即基因表达的空间特异性。,基因表达调控的生物学意义,适应环境和维持生长生物体所处的内、外环境是在不断变化的。生物体调节基因表达、适应环境是普遍存在的。维持个体发育与分化在多细胞个体生长、发育的不同阶段，细胞中的蛋白质分子种类和含量变化很大；即使在同一生长发育阶段，不同组织器官内蛋白质分子分布也存在很大差异，这些差异是调节细胞表型的关键。,致突变因素（外因）,物理因素-化学因素-生物因素物理因素：电离辐射是最重要的物理性致癌因素，主要包括以短波和高频为特征的电磁波的辐射以及电子、质子、中子、粒子等的辐射。放射性同位素：镭、铀、钴、锶等，致染色体断裂、易位、突变 紫外线：DNA吸收光子，嘧啶二聚体形成 电离辐射对生物靶损伤的机理主要是产生电离，形成自由基,物理因素,电离辐射是最重要的物理性致癌因素，主要包括以短波和高频为特征的电磁波的辐射以及电子、质子、中子、粒子等的辐射。放射性同位素：镭、铀、钴、锶等，致染色体断裂、易位、突变 紫外线：DNA吸收光子，嘧啶二聚体形成 电离辐射对生物靶损伤的机理主要是产生电离，形成自由基,化学致癌物,按作用方式分类：直接致癌物（direct carcinogen）烷化剂和硫化剂、金属元素、非金属元素、有机化合物等 间接致癌物（indirect carcinogen）多环芳烃、芳香胺、亚硝胺、霉菌毒素等 促癌物：巴豆油、激素、糖精、苯巴比妥等相关基本概念：前致癌剂、近似致癌剂、终末致癌剂-代谢活化作用,化学致癌物,按化学结构分类（包括内源性和外源性）：烷化剂多环芳烃类芳香胺与偶氮染料亚硝胺类霉菌毒素激素其它,生物学因素,致癌性DNA病毒DNA病毒转化细胞模式：病毒感染、DNA整合及细胞转化。常见DNA病毒：多瘤病毒、Papivloma病毒、腺病毒、Epstein-Barr病毒（EBV）致癌性RNA病毒RNA病毒转化细胞模式：反转录、cDNA整合及细胞转化。常见RNA病毒:白血病病毒、肉瘤病毒、腺泡病毒,逆转录病毒和携带癌基因的病毒,其它生物因素,与人类肿瘤密切相关的病毒HPVEBVHBVHTLV-1细菌：幽门螺杆菌与胃淋巴瘤相关 霉菌：黄曲菌、白地霉菌于肝癌相关 寄生虫：血吸虫、中华睾吸虫于肝癌相关可能与局部组织修复性增生失控有关,致突变因素（内因）,遗传因素：常染色体显性遗传；单基因遗传，需两次突变，儿童多见，如：視母、肾母、神经母；常染色体隐性遗传：Bloom syndrome与白血病、着色性干皮病与皮肤癌；遗传易感性与家族史。免疫因素：免疫细胞；肿瘤抗原；免疫耐受。其它因素：性别：男性的前列腺癌、女性的乳腺癌；年龄：青少年多发急性淋巴细胞白血病、中年以后则以慢性粒细胞白血病多见；激素：滥用问题。,Oncogene,癌基因:凡是编码生长因子及其受体，细胞信息传递分子以及转录因子的基因均可属于原癌基因（pre-oncogen）。,癌基因的分类,生长因子类癌基因生长因子受体类癌基因非受体蛋白质酪氨酸激酶癌基因细胞质蛋白质激酶类癌基因G蛋白质类癌基因核结合蛋白类癌基因,主要癌基因的细胞内定位,70年代的两种学说,基因突变学说、基因外（epigenic）恶性变学说。肿瘤基因的发现证明了在肿瘤发生过程中，既可发生编码区的突变（如ras），也可发生调节顺序的改变（如myc）以及Trans激活（如T细胞白血病病毒HTLV-及型中TAT基因）。因此，两种学说随着肿瘤基因的发现而得到统一。,病毒和化学致癌,肿瘤基因的研究证明化学致癌剂能直接引起原癌基因突变（ras基因族），同时有可能激活内源性逆转录病毒。具有致瘤作用的逆转录病毒本身含有v-onc；DNA肿瘤病毒中某些基因片段,如某些腺病毒的Ela，Elb;SV40的T及多瘤病毒的T基因本身具有肿瘤基因myc和ras相似的作用。目前认为这两类致瘤因子（病毒和化学因子）很可能有协同作用。,细胞遗传学,70年代后期，染色体的高分辨分带技术的发展使得在多种肿瘤中发现了染色体的易位、双微体及均匀染色区。肿瘤基因的研究给细胞遗传的研究，尤其对染色体的畸变赋予了功能性的意义；同时应用细胞遗传技术，不仅确定了肿瘤基因在染色体上的定位而且找出了新的肿瘤基因（如B淋巴细胞瘤的Bcl1及2，T淋巴细胞瘤的Tcl1等）。,传递生物信息的物质,Antioncogene,抑癌基因:凡能抵消癌基因的作用，阻止细胞癌变的基因，称为抑癌基因（antioncogen），也叫做肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。包括癌基因产物拮抗物基因，细胞生长抑制基因，诱导细胞分化的基因和抵消致癌物作用的基因等。,抑癌基因,确定抑癌基因的基本特征：在相应的正常组织中有正常的表达；在该组织类型的癌瘤中有缺失或突变；导入该基因缺陷的癌瘤细胞中，可以抑制恶性表现。主要抑癌基因Rb（retinoblastoma）与视网膜母细胞瘤相关基因。P53，与多种肿瘤发生有关。其它抑癌基因：p16,p15,PTEN,BRCA,DCC,APC等。,抗肿瘤基因存在的实验证据,遗传性肿瘤中某些基因的丢失早在70年代已有证明，某些遗传性肿瘤中染色体的某些位点可发生特异性的丢失。如视网膜母细胞瘤40属先天性；这些遗传性病例中（大多为双侧性）的患儿，在生后约5可见染色体13q14的一个等位基因位点的缺失，尚可能有形态学上不能分辨的其他缺失。,抗肿瘤基因存在的实验证据,肿瘤发生时，肿瘤细胞中另一个等位基因也发生了缺失，成为基因缺失纯合体。这提示，第一次的缺陷属先天性，第二次属体细胞突变。因为只是两个等位基因同时缺失时才会发生视网膜母细胞瘤，因此这种抗视网膜母细胞瘤形成的基因（Rb）具有显性的意义。A.Kmudson从这一事实提出了“两次突变”学说。,抗肿瘤基因存在的实验证据,根据酯酶D的测定和与染色体13有关的限制性内切片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP），证明至少50的视网膜母细胞瘤细胞中存在纯合体的13q14、20缺失。经治疗痊愈的儿童易患肉瘤，而这种瘤细胞中也发现了13号染色体标志位点的缺失。,抗癌基因主要功能,(1)诱导终末分化(2)维持基因稳定(3)触发衰老，诱导细胞程序性死亡(4)调节细胞生长(5)抑制蛋白激酶活性(6)改变DNA甲基化酶活性(7)调节组织蛋白酶活性(8)调节血管形成(9)促进细胞间联系,Rb基因,1986年，美国哈佛大学、麻省理工学院的小组和加州大学的小组分别分离出Rb基因的cDNA及其DNA序列分析。这无疑成为抗肿瘤基因研究的一个重要里程碑。.等人用一个定位于13q14、11，以前用于Rb基因限制性内切酶长度多态性研究的DNA片段H3-8为探针，从人胎盘cDNA文库中筛选出一个4.7kb的cDNA片段，并同时分离出相应的基因片段的克隆，用上述cDNA为探针，可在正常人的组织DNA中看到杂交信号，而在部分的视网膜母细胞瘤的DNA中则可看到信号的缺失。如果用Nouthern印记杂交的技术来检测正常人某些组织及视网膜母细胞瘤的mRNA，可发现在前者有4.7kb的信号，而后者则此mRNA缺失。目前该cDNA的全部DNA序列已经测出。,抑癌基因Rb,Rb基因是第一个分离到的抑癌基因，在视网膜母细胞瘤中发现。Rb基因位于人染色体13q14，全长至少200kb，含有27个外显子，可转录出4.7kb的mRNA，编码含有928个氨基酸、分子量105kD的蛋白。它是一种存在于核内的蛋白质，有磷酸化与非磷酸化两种形式。其磷酸化作用随着细胞周期发生改变，在S期，磷酸化程度最高；而在细胞有丝分裂后进入G1期的时候，磷酸化程度最低。未磷酸化的P105-RB能抑制细胞的增殖过程。RB蛋白在静止细胞中与E2F结合成复合物，抑制E2F的转录活性。RB蛋白还可通过抑制多种原癌基因（如c-myc和c-fos）的表达而抑制细胞增殖。,抑癌基因Rb的增殖抑制作用,抑癌基因P53,P53蛋白首先发现于SV40转化的小鼠细胞中，70年代末，它与SV40的癌基因产物结合成复合物，是维持转化细胞表型所必需的，因此被称为癌抗原，基因称为癌基因；主要是由于当初发现的P53蛋白及其基因均为突变型，具有促癌作用。80年代末，在癌旁组织发现野生型P53蛋白及其基因，有抑癌作用，方将P53基因命名为抑癌基因。P53蛋白成为野生型P53蛋白；在已发现的人类肿瘤中，有50%以上含有突变型P53基因。,P53 基因的结构,人类P53基因定位于17号染色体的短臂，全长20kb，共有11个外显子和10个内含子。人的p53基因的mRNA转录受凉个启动子P1、P2控制，P1位于第1外显子上游400个核苷酸处，P2位于第1内含子的5端。各种组织细胞中剪接加工的p53的mRNA长度约，以脾脏、胸腺中水平最高，其余组织中较低。,P53蛋白的结构与功能,P53蛋白含393个氨基酸，一级结构分三个结构域，由N端开始，17-80区含酸性氨基酸较多，二级结构大部分为-螺旋，第二结构域包括75-150肽段，含疏水的脯氨酸较多为疏水区，二级结构为长短不等的片层结构，其中有11个片层相互反向回折成夹心结构，为核心的疏水区，也是高度保守和突变区。第三结构域包括C-端的319-393肽段，含碱性氨基酸较多，为碱性区。三段的主要功能：一区为转录因子，促进基因转录；二区与DNA特异序列结合；三区与P53蛋白分子的四聚化及与DNA非特异结合有关。,P53的生物学功能,抑制细胞增殖：p53蛋白可抑制cyclin A的表达，cyclin A过量表达可促进细胞在DNA复制不完全时即可进入M期而致癌。大约60%的肿瘤有p53的突变或缺失。P53的酸性氨基末端结构趋具有转录激活作用，它能激活一些抑制细胞分裂的基因而间接抑制细胞增殖。促进DNA损伤的修复：p53能阻碍DNA聚合酶与DNA复制起始复合物的结合而抑制DNA复制的启动，进而阻止DNA的复制。诱导细胞凋亡诱导分化发育,原癌基因的激活,（一）原癌基因的结构改变点突变LTR插入基因重排基因缺失基因扩增,（二）基因领域效应常染色质异染色质活化（三）DNA的甲基化程度降低：甲基化与基因表达；甲基化与肿瘤发生,点突变,点突变是指基因的个别碱基发生替换。有意义的突变使氨基酸发生改变，蛋白质肽链中重要氨基酸的替换，可改变其空间结构和功能，点突变也可改变RNA的剪接位点，使其发生错误剪接而改变蛋白质的结构和功能。原癌基因的产物大多为生长因子、生长因子受体、信号传递因子及转录因子，起着调节细胞增殖的功能。这类蛋白质的重要氨基酸的改变使蛋白质的活性增强，加强了对细胞增殖的刺激作用。点突变常见于ras癌基因。,Ras 癌基因的点突变,主要发生在第12位氨基酸的改变，其次是第13位，第61位或63位氨基酸的改变。在正常细胞中，P21几乎全部与GDP结合，处于非活性状态。研究发现ras的12、13和61位点是ras蛋白与GTP酶激活蛋白GAP相互作用的关键结构，这些突变阻断了GAP激活ras蛋白的GTP酶活性的作用，使结合于ras上的GTP不能被水解，从而使ras处于持续激活状态。Ras癌基因突变见于多种肿瘤，如在膀胱癌、甲状腺癌、宫颈癌中发现H-ras突变；在急性骨髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、黑色素瘤、神经母细胞瘤中有N-ras突变；在肺腺癌、结肠癌、胰腺癌、胆管癌等中有高频率的K-ras突变。,启动子插入,反转录病毒两端的LTR结构中含有很强的转录启动子，当LTR插入到原癌基因的启动区域或邻近处，可改变其转录调控状态，启动或促进该基因转录。最常见的被插入激活的原癌基因是c-myc。白细胞增多症病毒ALV可诱导鸡B细胞淋巴瘤，ALV感染宿主细胞后，病毒在复制整合时，将其前病毒的LTRs插入到c-myc原癌基因上游，LTRs含强启动子，导致c-myc表达增强。,启动子插入,ALV前病毒的LTRs也可插入到c-myc基因的2、3外显子的上游，或基因的下游，均可提高c-myc的表达。原癌基因c-sis,erbB,H-ras,myb等被LTRs插入激活后，转录明显增强。但插入位置的差异对转录的影响不同。,基因扩增与高表达,基因拷贝数的增加即为基因扩增。基因扩增导致染色体结构异常，最初表现为游离基因，进一步聚集形成双微小染色体（double minute chromosomes,MDC）以及均染色体（homogeneously staining region,HSR）。DMC是缺乏着丝点的类似小染色体结构，HSR则为存在于正常着丝点染色体的扩增DNA序列区域。可能由于DMC缺少着丝点，在细胞分裂时不稳定，则通过DMC整合至染色体形成HSR，成为稳定遗传形式。原癌基因扩增使转录模板增加，进而使其mRNA的水平增高，所翻译的癌蛋白量急剧升高，导致正常细胞调节功能紊乱而致癌。基因扩增也见于多种肿瘤。,染色体易位,原癌基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置上称为易位。易位使原癌基因失去了正常的转录调控环境而被激活。原癌基因常易位于另一具强启动子或增强子基因的附近，受启动激活，或者易位后失去原旁侧的抑制性调节域，是其表达增强。免疫球蛋白重链、轻链或J链在功能性基因重排时发生差错，常将c-myc基因重排在这些基因的启动子后面，导致原癌基因c-myc转录水平升高。,领域效应-基因可转录条件,核小体的核心由一条DNA超螺旋链和四种成对组蛋白的八聚体构成。组蛋白家族成员分子量较小，富含带正电荷的赖氨酸和精氨酸，与DNA有很大亲和力；核心DNA超螺旋与八聚体接触的内界面，其它蛋白质（核酸酶或转录因子）难以靠近。亚核小体（四聚体核心颗粒）的形成是有效转录的前提条件。,DNA甲基化,真核细胞基因组DNA中，有2%-5%胞嘧啶甲基化，其甲基化的程度和模式随动物种属、组织细胞和发育阶段而已，此特性可代代相传。在无转录活性的异染色质区富含高度重复序列，甲基化更为广泛；在具有转录活性的染色质区CCGG序列只30%-40%甲基化。甲基化的CpG岛明显促进DNA分子呈Z型构象。DNA甲基化对转录的抑制，取决于甲基化程度及其位点的分布。,抑癌基因与细胞增殖细胞增殖抑制,DNA病毒激活细胞增殖的机制,