分子生物学Chapter-6-基因表达的调控.ppt

Chapter 6基因表达的调控Control of Gene Expression,几个重要的观点和概念,生物个体的各种组织和细胞具有全套相同的基因组，含有生物体生长、发育、新陈代谢和繁殖所需要的全部遗传信息。基因组中基因的表达具有时空性：所有基因并非以同样的强度、时时刻刻地表达不同组织和细胞表达的基因种类、数量和强度不同 组织特异性表达（Tissue-specific expression）在不同的发育阶段表达的基因种类、数量和强度也不同 时序性表达（Temporal expression）,基因表达的方式：组成型表达：基因（如：管家基因House-keeping gene）在不同的组织细胞和不同的生长时期中以几乎相等的强度表达。诱导型表达：基因（如：奢侈基因Luxury gene）的表达具有明显的时空性，或受到不同的内外因素因素影响。基因表达受到精细的调控：真核生物和原核生物的基因表达调控方式具有共性通过核酸分子之间、核酸和蛋白质分子之间、蛋白质分子之间的互作调控基因表达在基因表达的不同水平上进行全方位调控，其中以转录水平的调控最为经济和有效。,几个重要的观点和概念,转录前的调控,转录水平的调控,转录后的调控,翻译水平的调控,翻译后的调控,通过对转录单位的选择调控表达的基因种类并控制基因产物的种类；通过转录水平的调节来提高生物体的适应性；转录过程中顺势作用元件和反式调控因子的相互作用严格和灵活保证调控的高效和多样；,6.1 原核生物转录水平的基因表达调控,一、操纵子模型和原核生物基因表达调控的主要模式总论二、典型操纵子的基因表达调控模式（3个综合实例）三、严紧控制的应急反应,一、操纵子模型,1961，Jacob&Monod:研究大肠杆菌的乳糖利用时提出乳糖操纵子（Lac operon）模型。,PI,O,P,LacI,LacZ,LacY,LacA,Promoter启动子,Control element,Polycistron(多顺反子)mRNA,-半乳糖苷酶b-galactosidase,透过酶permease,转乙酰基酶transacetylase,Structural Gene,Operator操纵基因,与操纵子有关的几个名词,一些功能相关的基因紧密连锁在一起受同一操纵序列协调的控制其转录，并生成一个多顺反子。操纵基因（Operator）：顺式作用元件，能与调控蛋白结合从而调控基因转录起始效率。调控基因：如Lac Operon中的LacI基因，编码调控蛋白作为反式作用因子，通过与相应顺式元件结合后调控基因表达。编码阻遏蛋白，与操纵基因结合对基因表达进行负调控。编码激活蛋白，与操纵基因或上游控制元件结合对基因表达进行正调控。,与操纵子有关的几个名词,操纵子是原核生物基因组织和基因表达调控的主要方式。效应物（Effector）：能与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间构象，从而改变基因转录水平的物质，多为内外源因子。诱导物（Inducer）：诱导操纵子开放基因表达辅阻遏物（Corepressor）：不直接作为阻遏物，但可以与调控蛋白结合后阻遏操纵子基因表达,操纵子调控基因表达的4种模式,注：一个特定的操纵子往往组合使用其中的多个调控模式。,二、典型操纵子的基因表达调控模式,基因表达的负控制负控诱导模型：乳糖操纵子负控阻遏模型：色氨酸操纵子基因表达的正控制分解代谢产物阻遏启动子的正控制：乳糖操纵子操纵子基因表达调控的实例：乳糖操纵子组氨酸利用操纵子,负控诱导模型：乳糖操纵子,E.coli,Conclusion:Lac operon is activated through adding lactose(inducer).,没有葡萄糖的培养基上,适时添加或去除乳糖,Negative regulation of lac operon,PI,O,P,LacI,LacZ,LacY,LacA,Constitutive express,mRNA,Gene:OFFNo mRNA products,repressor,Lac operon#3,Negative regulation of lac operon,PI,O,P,LacI,LacZ,LacY,LacA,Constitutive express,mRNA,Gene:ONmRNA product,-Galactosidase,Permease,Transacetylase,Iso-lactose,RNA polymerase,Iso-lactose,Lac operon#4,几个要点,无异构乳糖（诱导物）时，基因的表达被阻遏蛋白阻遏而关闭；有异构乳糖（诱导物）时，基因表达被开放。,异构乳糖的存在是基因开放的前提,异构乳糖的来源,吸收进入细胞,培养基中的乳糖,在胞内：转化为异构乳糖,透过性酶,-半乳糖苷酶,两个矛盾:,Question:How the lactose enters into the cell and forms iso-lactose?,胞内预存有透过酶以将诱导物运输进入胞内 vs.透过酶的诱导合成,真正的诱导物异构乳糖由乳糖经-半乳糖苷酶催化转化而得vs.-半乳糖苷酶的诱导合成,解释：,PI,O,P,LacI,LacZ,LacY,LacA,泄露表达（Leaky Expression）：没有乳糖存在时，阻遏蛋白偶然脱落，使下游结构基因保持本底表达。所以，细胞内含有极少量的基因表达产物。这些产物足以运送少量的外源乳糖进入细胞。,当乳糖成为唯一碳源时，起初本底表达的产物使少量的乳糖进入细胞，并被转化成异构乳糖，获得真正的诱导物。,异构乳糖诱导下游结构基因高效表达，使基因产物大量合成；导致运送大量的乳糖进入细胞，一方面分解产能，另一方面转化为异构乳糖维持基因的持续表达。,Summary:Negative regulation of Lac operon,Lactose operon is inducible.乳糖操纵子的基因表达是可诱导的。LacI gene encodes the repressor(acts as the negative regulator)for the Lactose operon.LacI基因编码乳糖操纵子的阻遏蛋白。Before induced,leaky expression of the Lactose Operon lead to maintenance of the pre-prepare status inside the cell.诱导前，乳糖操纵子的泄露表达维持了胞内的预备状态。,负控阻遏模型：色氨酸操纵子,分解代谢产物阻遏启动子的正控制(例：乳糖操纵子),Growth,-Galactosidase,a,b,a,图例,上述实验结论：,大肠杆菌可以利用葡萄糖和乳糖作为碳源。在同时存在葡萄糖和乳糖时，大肠杆菌首先利用葡萄糖，乳糖操纵子的基因表达被抑制。只有在没有了葡萄糖这一优先碳源后，乳糖操纵子被激活表达而利用乳糖作为碳源。可见：葡萄糖的存在导致乳糖操纵子基因表达的抑制乳糖的存在是乳糖操纵子激活表达的必须条件；但仅有乳糖存在不足以激活乳糖操纵子的表达。,解释：cAMP-CAP 复合物作为正调控因子激活基因表达,PI,P,O,LacI,LacZ,LacY,LacA,cAMP,cAMP受体蛋白(CAP),Gene:on and activated,RNA Polymerase,cAMP-CAP complex,Positive regulation of Lac operon,操纵子调控的综合实例 1：乳糖操纵子,负控制：LacI基因编码阻遏蛋白；诱导物异构乳糖使阻遏蛋白构象改变，从而诱导基因表达开放。,正控制：cAMP-CAP复合物作为正调控因子，激活基因表达。,Binding site of regulation factors（Summary for regulation of Lac operon）,-82,+1,-7,+28,-87,-49,-48,+5,-5,+21,正调控因子（cAMP-CAP复合物）,RNA polymerase,负调控因子（阻遏物）,操纵子调控的综合实例 2：组氨酸利用操纵子,负控制：C基因编码阻遏蛋白，在没有组氨酸时阻遏转录；当组氨酸存在时，组氨酸被降解产生尿苷酸，尿苷酸作为诱导物结合到阻遏蛋白上并改变其构象，激活转录。,阻遏蛋白,尿苷酸,组氨酸,正控制：,C源不足时,N源不足时,二、衰减子及其对基因表达的调控,衰减子的发现1968，Imamato Lab发现：在色氨酸操纵子的调控中，当胞内色氨酸少且不足以作为辅阻遏物时，基因表达开放，但是转录启动后又大量的转录过程仅进行到第一个结构基因前，基因表达提前终止 衰减作用（Attenuation）。在色氨酸操纵子中，行使衰减作用的顺式作用元件是前导区（Leader）中的衰减子（Attenuator）。,色氨酸操纵子的负调控：色氨酸浓度高时基因表达关闭 色氨酸浓度低时基因表达开放,二、衰减子及其对基因表达的调控,衰减子的发现1968，Imamato Lab发现：在色氨酸操纵子的调控中，当胞内色氨酸少且不足以作为辅阻遏物时，基因表达开放，但是转录启动后有大量的转录过程仅进行到第一个结构基因前，基因表达提前终止 衰减作用（Attenuation）。在色氨酸操纵子中，行使衰减作用的顺式作用元件是前导区（Leader）中的衰减子（Attenuator）。,High trp:,色氨酸含量高时：核糖体在翻译时快速通过“双密码子”位点，而覆盖了区域1和2，使已转录的mRNA上的区域3和4形成不依赖于因子的转录终止子，导致转录终止。,Low trp:,色氨酸含量低时：核糖体在经过“双密码子”位点是速度慢，使区域2和3形成茎环结构，区域4空闲，转录继续进行。,色氨酸操纵子基因表达衰减作用的几个要点,从色氨酸操纵子的前导区的结构特征：它们的一级结构具有4段可两两配对形成茎环结构的序列；具有一段可编码14Aa短肽的ORF；该短肽的ORF的第10、11个密码子为连续排列的两个Trp密码利用大肠杆菌的Trp-AARS的温度突变体研究表明：空载的tRNATrp是衰减作用的直接信号，色氨酸操纵子的基因表达的衰减与引导区的特殊结构及其蛋白质合成有关。（见教材P227）色氨酸不是衰减作用的直接信号；空载的tRNATrp作为直接信号调控了前导肽合成中核糖体的移动速度，从而控制了操纵子mRNA合成的长度和效率。衰减机制发挥作用的前提是基因表达已经开放。衰减机制是原核生物对基因表达进行精细调控的一种方式。,操纵子基因表达调控的综合实例3：色氨酸操纵子,负控制：trpR基因编码非活性阻遏蛋白；当胞内色氨酸过量时，色氨酸作为辅阻遏物与非活性的阻遏蛋白结合而阻遏基因表达，减少色氨酸的合成。,衰减作用：当胞内色氨酸含量低时，色氨酸操纵子开放表达。此时，依据色氨酸浓度变化，通过衰减作用精细的调节基因表达。,三、严紧控制的应急反应,蛋白质合成过程中，结合到核糖体A位上的tRNA是空载的（无氨基酸结合），阻断了肽键的形成，造成GTP的积累。,积累的GTP被用做合成魔斑核苷酸,魔斑核苷酸作为阻遏物特异性的阻遏rDNA操纵子，关闭rRNA的转录，阻止tRNA的延伸，抑制蛋白质的合成。,同时活化某些操纵子（如氨基酸操纵子），合成急需的氨基酸；活化蛋白水解酶，水解蛋白质以提供氨基酸单体。,氨基酸严重缺乏时,魔斑 II,魔斑 I,6.2 真核生物的基因表达调控以正控制为主,一、基因表达调控的模型,整合子-感受子正调控模型（Integrater-Receptor Model of Positive Control）,Brittein R.J.&Davidson E.H.,Science,1969,165:345457,多整合子系统（多激活子模型）,多感受子模型,Signal transduction&gene expression control,TF be Regulated by hormone,Activated,Activation domain,DNA binding domain,Hormone binding domain,N,C,binding to HRE,Regulate expression,Hormone,6.3 DNA水平的基因表达调控：DNA重排和转换,一、沙门氏菌鞭毛的H1-H2抗原相的转变二、酵母交配型的转变三、免疫球蛋白的多样性,一、沙门氏菌的抗原相的转变（Phase variation）,许多沙门氏菌具有两个非等位基因控制鞭毛蛋白的合成并表现两种不同的抗原相：H1型抗原相H1 基因 H2型抗原相 H2基因 两种抗原相可以发生转变：野生型细菌中有1的机会发生。H2基因的表达对H1基因具有显性上位的抑制作用。,Hin蛋白引起hin片段倒位，使细菌H1和H2型抗原相相互转变。,约1机会出现抗原相的转变。,阻遏H1的表达,引起倒位,二、酵母交配型的转换,基因型单一的酵母群体,无性繁殖,不利环境因素作用而导致群体崩溃，物种灭绝！,酵母主要的繁殖方式:无性繁殖,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a,交配,酵母繁殖的另外两种方式,不同交配型之间的交配结合,减数分裂而生成孢子,方式一、不同交配型的酵母之间进行交配,二倍体,方式二、同宗接合中的交配型转换（Mating Type Switching）,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a,a 的交配型转换,a的交配型转换,a,无性繁殖,无性繁殖,方式一,Cassette Model（暗箱模型）,SIR(1-4)Silent Information Regulator,Negative controlling 负控制,silent cassette active cassette silent cassette,HML,MAT,HMR,a,/a,thr4,leu,a,thr4,leu,HML,MAT,HMR,MATa,HML,结合型基因转换的分子机制,三、免疫球蛋白多样性的分子基础,人类免疫系统的免疫反应：细胞免疫：T细胞调节免疫应答，杀伤抗原等 体液免疫：B 细胞产生抗体，而抗体的形成具有十分相似的特征与形成机理(专一性，记忆性，多样性),免疫球蛋白重链的重排,DNA 水平的重排,5 L1-V1-CACAGTG-11 Nt-ACAAAAACC-L2-V2-CACAGTG-11Nt-ACAAAAACC-L3V3 GGTTTTTGT-23Nt-CACTGTG-J13,9Nt,7Nt,7Nt,9Nt,免疫球蛋白的DNA重排的机制,轻链基因：,Any V region of V family recombination with any J region of J family,leads to Ig diversity,Recognition signal,stemloop excised unexactly,leads to Ig diversity,L3,Vn,轻链的基因家族中：V 基因有300个拷贝J 基因有5个拷贝C 为单拷贝,重排时可产生：300*5*1=1500 种组合可能性,L（/）300(V)5(J)1500,H n 100(V)20(D diversity)4(J)10(C)n 80000,Ig的可能种类的数量:1500 n 80000 10 100 n 12 1010,远远多于抗原的种类（数百万种）,Level 1:,Level 2:,Thus:,免疫球蛋白的多样性,6.3 转录后调控机制,一、真核生物转录后加工二、RNAi三、反义RNA,一、转录后加工的调控,略。见“转录后加工”一节,二、RNAi（RNA干涉）,定义：外源或内源性的双链RNA（dsRNA）进入细胞后引起与其同源的mRNA特异性降解，抑制相应基因表达，表现出特定基因缺失表型的现象。,RNAi的基本原理,RNAi的特征,三、反义RNA对基因表达的调控,反义RNA：一种小分子RNA，可以与特定的RNA或DNA区域互补结合，对复制、转录、翻译等进行调控。,E.coli:OmPc 蛋白+OmpF 蛋白=恒量,micF RNA,Unable to be translated，no OmpF produced.,OmPc 蛋白,OmpF 蛋白,E.coli 在高渗透压下的基因表达调控,micF RNA acts as an antisense RNA that can bind the upstream of the ompF RNA to inhibit translation.（micF RNA 作为小分子的反义RNA，结合在ompF RNA 的5端而阻遏其译。）,SD序列,Initiation codon,反义RNA抑制基因表达的作用机制,6.4 翻译水平的调控,1、翻译起始的调控2、翻译终止的调控3、同一操纵子内的基因的产物量的调控4、核糖体蛋白质合成的自体调控 5、翻译中的弱化调控,1、翻译起始的调控,小亚基与模板mRNA的识别和结合是翻译起始中极为重要的一步！mRNA上的SD序列和16sRNA互补配对，使模板和核糖体小亚基结合起来。,accuccuua,16s rRNA,5,AGGA,mRNA,3,核糖体小亚基,5,accuccuua,3,2、翻译终止的调控-终止密码的解读和通读调节,例一、+1移码阅读-释放因子RF2的自体调节,在Leu25Asp26两密码间插入一个U,形成15Nt的移码窗口：,5-AGG-GGG-UAU-CUU-UGA-3,保证核糖体在UGA处仍与16s rRNA结合；发生+1移码识读，翻译继续,类S.D.序列,+1特异滑动配对信号,例二、反转录病毒 gag-pol基因的-1 移码阅读,S K K I 终止,S K K D L,gag 基因正常翻译时：只有gag基因产物,反转录病毒进行复制时：gag基因发生-1移码阅读，而翻译后面的pol 基因,5UCAAAAAAGAUCUAA,1 frameshift reading,3、同一操纵子内不同基因的产物量的调控,翻译的极性稀有密码子的使用mRNA高级结构的影响基因重叠的影响,翻译的极性,后续基因的翻译起始的频率比前一个基因低。离启动子越远的基因，其产物量越少。,Lac：Polycistron mRNA,5（-半乳糖苷酶）,2 透过性酶,1 转乙酰基酶,离mRNA 5端越远，核糖体小亚基与模板的结合能力越低，越容易脱落。,Promoter,dnaG50,rpoD2800,rpsU40000,引物酶,RNA聚合酶的亚基,核糖体的S21 蛋白,稀有密码子的使用,mRNA 二级结构对翻译的调节,如：RNA virus R17通过对翻译起点的控制，调节蛋白质的合成量及比例,Cp基因：外壳蛋白Ap基因：侵染附着蛋白Rep基因：复制酶蛋白,蛋白质 Ap:Cp=1:180,Ap 基因的AUG：隐藏在双链区域,Cp 基因的AUG：暴露在单链区域,由于第一个基因ap的起始密码被隐藏而无法翻译；第二个基因cp的起始密码暴露，所以得以翻译。,Rep蛋白结合在+RNA的3端，开始复制获得-RNA；并以新合成的-RNA为模板合成新的+RNA,5,3,Cp蛋白可结合于rep的AUG处而阻遏Rep蛋白的持续合成,Cp蛋白可继续合成,3(-RNA)5,5(+RNA),3(-)5,ap,5(+),在新的+RNA 的合成过程中，ap得以暴露而翻译获得Ap蛋白（）。但是暴露的时间很短，所以合成的蛋白量很少。,新合成的+RNA 重新形成二级结构而将ap基因的AUG 隐藏起来。,重叠基因对翻译的影响,UGA,AUG,Couple-translation of trpE and trpD:So:E and D 产物等量合成,Stop codon,Start codon,SD sequence for galK gene,gal operon in E.coli,galT,galK,So:T=K,4、核糖体蛋白质合成的自体调控,核糖体蛋白的合成与rRNA合成严格协调！这种调控的特点：核糖体蛋白基因分布在不同的操纵子中；这些操纵子中，有一个核糖体蛋白质基因作为自身操纵子的调节子基因；调节子基因的产物是调节子，它具有双重功能：一是参与核糖体组装，二是与自身操纵子的mRNA结合 而关闭翻译。,6.4 真核生物基因表达调控的特殊类型,一、原核生物和真核生物基因结构和表达调控的差异二、真核生物DNA水平的调控三、翻译水平的调控,一、基因表达调控的差异原核生物 vs 真核生物,1、真核生物基因组的复杂性,真核生物基因组大得多。真核生物基因组被组装成染色质并包裹在核内，与核外基因组（mtDNA,ctDNA）构成其基因表达调控的层次性和复杂性。真核生物基因为断裂基因，其表达受到明显的转录后调控。原核生物以操纵子组装和调控基因及其表达；真核生物的基因分别组装和表达，通过不同基因之间的协调来控制一个生物学过程的进行。已知真核生物基因只有少数的序列用于编码蛋白质或功能RNA，其余80%以上的序列功能未明。真核生物存在大量的重复序列。真核生物的基因成套组装成“基因家族”。,原核生物 vs 真核生物,一些已知的基因组的大小比较,1995-2002 Bacteria 细菌(about 80 organisms);0.5-5 Mb;hundreds to 2000 genes1996 April Yeast 酵母(Saccharomyces cerevisiae)12 Mb,5,500 genes1998 Dec.Worm 线虫(Caenorhabditis elegans)97 Mb,19,000 genes2000 March Fly 果蝇(Drosophila melanogaster)137 Mb,13,500 genes2000 Dec.Mustard 拟南芥(Arabidopsis thaliana)125 Mb,25,498 genes2001 Feb.Human 人类(Homo sapiens)3000 Mb,35,00040,000 genes,rRNA gene cluster(Pol gene),海胆组蛋白基因家族,珠蛋白基因家族,2、真核生物基因表达的复杂性,在DNA水平上通过重排、基因丢失和扩增、染色质结构修饰和重建等方式调控基因表达。以正调控方式、转录水平为主。基因表达调控的环节多。,二、DNA水平的基因表达调控,1、染色质结构的修饰和重建,基因表达的活性 vs.染色质结构异染色质区域 基因关闭表达常染色质区域 基因开放表达,基因表达开放的区域存在 DNaseI 超敏感位点:核小体结构不完整无组蛋白结合,DNaseI超敏感位点,裸露的DNA，易于被DNaseI降解。基因表达活跃的位点：调控区域 和 编码区组蛋白被修饰，引起核小体解开而DNA松弛。,组蛋白N-端的修饰,组蛋白密码,组蛋白乙酰化修饰与基因表达调控,组蛋白含大量的Lys+和Arg+，具有稳定组蛋白与DNA相互作用的作用。组蛋白的乙酰化主要发生在Lys+和Arg+残基上，部分消除了组蛋白的正电荷，使组蛋白与DNA的相互作用减弱，导致核小体结构不稳定而解体。,H3,H4(Lys5,Lys8)高度乙酰化,激活类似DNA解旋酶的活性,组蛋白脱离DNA,核小体解体,基因表达,DNA 负超螺旋化：DNA松弛,组蛋白甲基化与基因表达调控,组蛋白以S-腺苷酰甲硫氨酸为甲基供体，在甲基化酶的催化下将甲基转移到组蛋白的Lys和Arg上。甲基化的组蛋白静电荷发生变化，改变了组蛋白之间、组蛋白与DNA之间的静电作用，使染色质结构改变。,DNA甲基化与基因表达调控,甲基化能改变染色质结构、DNA构象、DNA稳定性、DNA与蛋白质相互作用方式甲基化常发生在：CpG的C（5-mC）少数在：N6-mA、7-mG两种甲基化酶：日常型甲基化酶（维持甲基化酶）从头合成型甲基化酶（重新甲基化酶）,DNA甲基化抑制基因表达机制：甲基化的CpG可招募组蛋白的去乙酰化酶，去除组蛋白上的乙酰基，致使DNA与组蛋白组装，抑制基因表达。,引起核小体可逆性结构改变的3个主要因素,2、基因拷贝数的改变,基因丢失,基因扩增,三、翻译水平的调控,1、翻译调控因子可逆磷酸化对翻译的调节,翻译起始过程中，eIF-2与GTP结合。,eIF-2 亚基上的Ser被磷酸化后，eIF-2与GDP亲和力增强，不能分离，导致无法重新形成eIF-2GTP，无法重新利用eIF-2而导致翻译速度下降。,2、mRNA结构对翻译的调控,5UTR区5UTR长度影响翻译起始的精确性和翻译效率：80nt或17nt，翻译效率下降5UTR的二级结构和GC含量对翻译起负调控作用起始密码的“前三后四”规则3UTR区Poly(A)长度影响翻译效率：通过影响mRNA半衰期3UTR含有富含AU的重复序列，该序列与PABP结合可加速mRNA的降解。,真核生物基因表达以正调控为主，在多个层次上进行表达调控,Orphanides,G.and Reinberg,D.,2002.Cell.108:439-51.,