分子生物学6-分子克隆.ppt

分子克隆（基因工程）,周坤福,前言,二十世纪40年代，基因分子生物学家确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质 1944年等证明了肺炎球菌转化因子是DNA 50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制 深刻意义在于：解决了基因自我复制和遗传信息的传递问题,50年代末和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功破译了遗传密码。从而阐明了遗传信息的流向和表达问题,DNA mRNA 蛋白质,转录,翻译,tRNA，rRNA,逆转录,复制,这些都为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础,基因工程的诞生,70年代初，DNA限制性内切酶的发现和一整套DNA体外重组技术又为基因工程的发展奠定了坚实的技术基础。1972年，美国学者Berg.P等人首次在体外把SV40（一种猴病毒）的DNA和噬菌体DNA分别切割，又将两者接在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。基因工程这门新兴学科也就由此诞生了。,基本概念,基因工程的核心是重组DNA技术（recombinant DNA technique），又叫DNA克隆（DNA cloning）。所谓克隆（clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。在基因工程中所指的克隆，是指在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，并将重组分子导入适合的宿主细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。,基本概念,这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆（molecular cloning）。由于研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆（gene cloning）。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程（genetic engineering）。基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程以及细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大动力。,细胞克隆技术：在制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术中运用的最为充分。,哺乳动物的克隆：克隆概念在个体水平上的应用,采用了核质分离、细胞融合、体外培养及胚胎移植等技术,主要内容,从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之实现功能表达。,应用实例,重组DNA技术跨越天然物种屏障，将原核和真核生物，植物和动物，细菌和人，动物和人的基因连接起来，进行基因交流。利用大肠杆菌（E.coli)、酵母、哺乳动物细胞表达系统来生产人类所需要的，从其他方法又难以大量获得的重组蛋白质。1、第一个用细菌表达的用于人类的基因重组药物人胰岛素上市（1979年美国基因技术公司）,牛、猪胰岛素，免疫反应化学合成人胰岛素基因插入E.coli表达载体中-半乳糖苷酶基因后融合蛋白溴化氰水解混合重建,2、用酵母细胞生产乙型肝炎病毒亚单位疫苗,包膜蛋白核心蛋白病毒DNA,乙肝病毒,用基因工程方法制备乙肝表面包膜蛋白为抗原亚单位疫苗无致病力，很安全、高效。,3、生物钢,扫描电子显微镜下的蜘蛛单丝表面,扫描电子显微镜观察下的蜘蛛单丝断面,蜘蛛丝被拉断时显示出的“皮”结构，也称鞘 结构（箭头所示部分）,蜘蛛丝被拉断时显示出的芯结构，也称剑 结构（箭头所示部分）,目前世界范围内开发的基因工程多肽药物、疫苗、抗体有五百多种,理论意义,1、彻底填平了生物种属间不可逾越的鸿沟2、重组技术缩短了进化单位3、能按人们的意愿定向改造、培育新品种4、解决医学与生物学上长期无法解决的许多重大（如是什么基因、在什么地方、什么时间、起什么作用？如何起作用？）,人们预言，21世纪是生命科学的世纪，以基因工程为主导的生物技术可能对世界的重大问题饥饿、疾病、能源、污染等提出切实的解决办法，推动社会生产力的飞速发展。,一、分子克隆中常用的工具酶,在重组DNA与基因工程中，对目的基因的分离、剪切和重组涉及到一系列酶催化反应，这些酶就像外科医生的手术刀一样，是进行基因工程操作必不可少的工具。常分为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）、连接酶（ligase）和核酸修饰酶（modifying enzyme）。,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶是指能识别DNA的特殊序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶。它主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该种限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。限制性内切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。,限制性核酸内切酶的命名,命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母；第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示。例如，从大肠杆菌（Escherichia Coli）RY13株中发现分离的第一种限制酶，称为EcoR I。,限制酶的分类及特点,根据限制酶的组成、辅因子及切割DNA方式不同，可分为I、II、III型。重组DNA技术中常用的是II型限制性内切酶。II型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5 端为磷酸基，3 端为羟基。识别顺序一般为46个碱基，通常是回文结构（palindrome）。识别序列的大小决定其切割DNA后产生的片段的长短。44256、464096、4865536,II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口：在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（blint end），如Hpa I：5 GTTAAC3 Hpa I 5 GTT AAC3 3 CAATTG5 3 CAA TTG 5 在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5 端切割产生5 端突出的粘性末端，如EcoR I：5 GAATT C3 EcoR I 5 G AATTC3 3 C TTAAG5 3 CTTAA G 5 从3 端切割产生3 端突出的粘性末端。如Pst I：5 C TGCAG3 Pst I 5 CTGCA G3 3 GACGT C5 3 G ACGTC 5,同工异源酶,1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 2.特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C SstI CCGC GG Asp718 G GTACC SacI CCGC GG,同尾酶,有些限制酶识别序列不同，但产生相同的粘性末端，称这些酶为同尾酶。如：BamH I(G GATCC)和Sau3A I(N GATCN)由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性,星号活力：限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异性识别顺序类似的序列，这种现象称星号活力。,诱发星号活力常见原因：1、高甘油含量（5%，V/V）2、内切酶用量过大，（100U/gDNA）3、低离子强度：8 5、含有机溶剂：二甲基亚砜、乙醇、乙烯二乙醇等 6、有Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+等非Mg2+的二价阳离子。,应用,在分子生物学和基因工程中具有举足轻重的地位。其主要胜用途：1、改造及组建质粒2、组建基因组DNA物理图谱3、基因组DNA同源性研究4、DNA重组克隆及亚克隆5、DNA杂交与序列分析,注意事项,酶切底物DNA要纯，抽提时酚氯仿要去除干净。所加酶量不应超过10（RE保存在50的甘油中20度较稳定）。取酶时量要准，最后加酶，最好在冰箱里加。酶切反应2小时左右，可延长，节约酶量。两种酶有相同的缓冲液，可双酶切；不同，先用需低盐缓冲液的限制酶消化，再用需高盐缓冲液的酶消化。,DNA连接酶,连接酶可催化DNA分子中相邻5 磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。常用的有T4（噬菌体）DNA连接酶和E.Coli DNA连接酶。,DNA聚合酶,重组DNA技术中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA为模板在体外合成DNA或RNA。可分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。常用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(klenow)以DNA为模板，催化5 3 核酸链的延长，另有3 5 的外切酶活性。常用于DNA 3 末端的标记和填充；cDNA第二链的合成，DNA测序。,磷酸酶,牛小肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase,CIP），催化DNA或RNA的5 磷酸基水解。常用于去除线状载体DNA两端的5 磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用32P标记DNA的5 末端之前除去原来的5 磷酸基。,逆转录酶,以RNA为模板，合成cDNA链（5 3），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一，二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。,名称 功能及应用大肠杆菌DNA聚合酶I 以DNA为模板，催化5 3 核酸链的延长，另有3 5 的外切酶 大片段（klenow）活性。常用于DNA 3 末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、DNA测序。Taq DNA聚合酶 以DNA为模板，催化5 3核酸链的延长，另有弱的5 3的外切 酶活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序。末端转移酶 催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA 3-OH连接而使DNA链 延长，无需模板。常用于3 端标记或形成DNA共聚尾巴。逆转录酶 以RNA为模板，合成cDNA链（5 3），另有RNA酶H活性。常 用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。RNA聚合酶 以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为 杂交探针。,二、分子克隆中常用的载体,基因工程载体（vector）是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。什么样的载体才是较为理想的呢？其基本条件是：能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。具有适当的限制性酶切位点，以便目的基因的插入。载体分子大小合适，太大不易复制；太小不易容纳较大目的基因。具有合适的筛选标记（如抗药性基因，酶基因等），以便筛选阳性克隆。如作为表达载体，要配备适当的调控元件，如启动子、增强子等。,载体的分类,一般常用的载体按来源分有质粒（plasmid）、噬菌体（phage）和病毒（virus）。天然的质粒、噬菌体、病毒都需经过人工改造才能成为合乎要求的基因工程载体。质粒和噬菌体常用于以原核细胞为宿主的分子克隆；动物病毒常用于以真核细胞为宿主的分子克隆。载体按得到的产物分类：克隆载体（cloning vector）主要用于DNA大量扩增，并不需要得到目的基因所编码的蛋白质。表达载体（expression vector），使插入的目的基因可转录、进而翻译成多肽链而设计的载体，具有表达外源基因的能力。,质粒载体,染色体,质粒,质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状，如质粒携带的氨苄青霉素抗性基因使宿主细胞对氨苄青霉素产生抗性，从而轻易地筛选出成功转化了质粒的细菌。载体质粒上往往还引入了“多克隆位点（multiple cloning sites）”，即一段人工合成的DNA序列，上面含有密集的多种限制性酶切位点，以供插入外源基因片段。另外，较好的载体往往还引入多种用途的辅助序列，如供蓝白斑筛选的 LacZ 基因。,pBR322 质粒图谱,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,多克隆位点,pUC 质粒图谱,突变型lac-E.coli表达-半乳糖苷酶的 片段。,如果插入的外源基因是在lacZ基因内，就会影响lacZ的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落。,多克隆位点,编码-半乳糖苷酶的片段,-互补：（alpha complementation）pUC质粒带有大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的一个片段LacZ基因，它编码-半乳糖苷酶的一个片段，而宿主细胞能编码与这个片段互补的-半乳糖苷酶的另一部分，实现互补，形成完整的-半乳糖苷酶，此酶能分解发色底物X-gal，形成蓝色菌落。当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。因此通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组体与非重组体载体。,噬菌体载体,是一种细菌病毒，可作为克隆载体。其优点是可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。目前使用的噬菌体载体主要有噬菌体衍生物载体、粘粒载体和单链M13噬菌体载体等。除M13噬菌体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入较大的外源DNA片段（如20kb以上）。,噬 菌 体,头部,尾部,尾丝,噬菌体感染细菌示意图,M13噬菌体,目前常用的单链载体是经改建的M13mP系列。其中引入了lacZ基因一部分和多克隆位点，因此也可用蓝白斑筛选重组DNA。M13噬菌体基因组是单链环状DNA，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链DNA转变成复制型双链DNA，可提取出来做基因重组。双链DNA在大肠杆菌中复制100-200拷贝后，M13的合成转变成不对称地合成双链中的一条，产生大量单链DNA，并包装成成熟的噬菌体颗粒，透出菌壁，释放到培养基中。因此可以从大肠杆菌培养基中分离单链DNA。,M13噬菌体的最大特点就是能产生单链DNA，这是独一无二的。因此从培养基上收获到的含目的基因的M13单链DNA可直接作为模板进行双脱氧链终止法测序和寡核苷酸定点突变。,噬菌体（lambdla bacteriophage）,噬菌体是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长（环状DNA在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌），又可以溶源生长（噬菌体DNA整合到细胞染色体基因组DNA中，与染色体DNA一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。,噬菌体基因组中功能相关基因集中分布。包装限制性。重组子大小在75105，可被包装成为成熟颗粒。DNA在体外可包装成病毒颗粒（将重组DNA包装进入头部或尾部蛋白中），并高效感染大肠杆菌。,粘粒载体（cosmid vector，又称柯斯质粒载体）,粘粒载体由质粒DNA和噬菌体DNA两部分组成。粘粒具有质粒的特性，在宿主细胞中能自主复制，有克隆位点，也有抗药性基因。同时粘粒又具有噬菌体的特性。在DNA中主要是DNA的粘性末端COS位点及其与包装有关的短片段。能按噬菌体DNA分子的同样方式环化起来，克隆外源DNA后，经体外包装能高效进入大肠杆菌细胞。粘粒的一大特点是能容纳长达3545kb的大片段外源DNA，因此常用作大片段外源DNA的克隆。,外源基因插入到两个线状粘粒之间 噬菌体的A蛋白切下COS位点以外部分，中间部分包装到外壳蛋白中，组成成熟的噬菌体颗粒。重组子与噬菌体DNA体外包装系混合,真核细胞用载体,真核细胞用作克隆基因的表达具有很多优点，如它能识别和剪切外源基因中的内含子并加工成成熟的mRNA，对表达的蛋白质进行翻译后加工和修饰（如糖基化）等，这些都是原核细胞办不到的。目前所用的真核载体大多是所谓穿梭载体（shuttle vector），它既含有原核细胞的复制原件，又含有真核细胞的复制原件，因此它既可以在原核细胞中复制扩增，也可以在真核细胞中扩增、表达。由于在原核体系中基因工程的重组、扩增、测序等易于进行，所以利用穿梭载体，首先把要表达的基因装配好后再转到真核细胞中表达，这为真核细胞基因工程操作提供了很大的方便。真核细胞载体又可分为哺乳动物细胞载体，酵母细胞载体和昆虫细胞载体。哺乳动物细胞载体通常是用能在真核细胞中复制的DNA或RNA病毒来构建，如腺病毒载体、逆转录病毒载体等。,人工染色体,前面我们提到过用粘粒载体可以克隆长达3545kb的外源基因片段，但是还有许多基因过于庞大，不能作为单一片段克隆于这些载体中。人类基因组、水稻基因组工程的工作需要能容纳更长DNA片段的载体，这就使人们组建了一系列人工染色体来满足克隆更长外源DNA片段的需要。如酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC），这是由酵母染色体基因组的基本功能单位和pBR322构成的，能自我复制的线性克隆载体。另外还有细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC），以及还在研究之中的哺乳动物人工染色体（mammalian artificial chromosome，MAC）。,三、目的基因的分离与合成,目的基因（target gene）又称外源基因，即我们所要研究的感兴趣的基因。从生物材料中制备出包含有目的基因在内的DNA片段，往往是分子克隆最重要的一步。,限制性内切酶直接分离获得,直接分离法用于一些物理图谱（物理图谱是指标明限制性核酸内切酶在DNA分子上的限制位点数目、限制片段大小及其排列顺序的图谱）已确立，背景资料比较清楚的原核生物基因的制备。从原核生物中提取纯化DNA后，根据它的限制酶物理图谱进行基因定位，用适当的限制性内切酶将巨大的基因组DNA分子切成多数片段，然后进行分子克隆。,从基因组文库中筛选,分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性内切酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将这些片段随机地同适合的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组DNA的所有序列。与一般图书馆不同的是：基因组DNA文库没有图书目录，建立基因组文库后，需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA分离、回收，以获得目的基因。,结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行扩增，将重组DNA分离、回收，以获得目的基因。,存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组DNA文库（genomic DNA library）。如人的基因组文库包括了单倍体23条染色体中所有的DNA。基因组DNA文库就像图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。,逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选,尽管同一生物体中不同组织细胞的基因组是相同的，但各种类型细胞之间以及同一细胞在不同的发育时期所表达的基因是各不相同的。大多数基因都会在相应的细胞中特异性地转录，如网织红细胞阶段，有丰富的珠蛋白mRNA。因此由这些高丰度mRNA经过逆转录得到与mRNA互补的cDNA（complementary DNA，cDNA），可直接进行克隆。,对于低丰富mRNA的cDNA克隆，通常是建成cDNA文库（cDNA library）。即把细胞总mRNA通过逆转录合成总cDNA，再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某种生物体全部cDNA集合。它的特点是它只包括已经被转录成mRNA的那些基因序列，且不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。但由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA种类就不同，由此产生的cDNA又是独特的。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。然后用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。,cDNA文库构建过程,化学合成法,如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出编码该多肽链的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。利用该法合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽及干扰素基因等。,聚合酶链反应,聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外快速的特定DNA片段扩增技术。PCR技术。可以从一个细胞、一滴血液、一根毛发中，经过30次左右的循环扩增，使目的基因扩增上百万倍。应用时，常常在目的基因5 端和3 端分别设计引物，引物中又分别引入合适的限制性内切酶切位点，以带有目的基因的载体或细胞基因组DNA为模板扩增，限制性内切酶酶切后，PCR产物两端易形成粘性末端而利于进一步克隆。,逆转录PCR（reverse transcription PCR，RTPCR）技术，使得人们可以从mRNA入手，通过逆转录得到 cDNA，在适当引物存在下，经PCR扩增目的基因。所得到的目的基因无内含子、无调控序列，而获得连续编码的序列。,以上几种获取目的基因的方法多用与编码序列已知的基因，目前人体已知基因只有110左右，所以获取大量未知基因则更为诱人和富于挑战性，所涉及的方法更多，如基因芯片技术、酵母双杂交技术以及噬菌体、细菌展示技术等等，这些都有待我们去进一步学习和研究。,四、DNA分子的体外连接,通过不同途径获取含目的基因的外源DNA，选择或改建适当的克隆载体后，下一步工作是如何将外源DNA与载体DNA连接在一起，即DNA的体外重组。这种人工DNA重组是靠DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5 端磷酸与3 端羟基之间形成磷酸二酯键。通常所用的连接酶是T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。,质粒载体,外源DNA,抗生素抗性基因,EcoR I,含重组质粒的克隆,转化进抗生素敏感的受体细胞,涂布含抗生素的琼脂平板,连接,EcoR I,外源DNA,含抗生素的琼脂平板,粘性末端连接,碱性磷酸酶处理载体分子后连接,如果是构建表达型重组体，因为启动子启动转录以及转录后翻译阅读都是有方向的，因此插入的目的基因也应注意方向。一般采用两种限制酶消化，由于粘性末端不同，载体分子和外源DNA片段只能按一种方向形成重组分子，实现定向克隆,定向克隆,连接效果与载体和目的片段质量有关3：1 10l连接反应一般约4-5小时，室温，20度左右,平端连接,因载体分子和目的DNA分子之间并不一定都产生互补的粘性末端，有的限制性内切酶只能切成平端。有时所需用的两种限制性内切酶切割后形成非互补的粘性末端，此时需设法使之变成平端，如用S1核酸酶消化或用Klenow片段和dNTP补平3 端，成为平末端。平末端仍用T4DNA连接酶连接，只是效率低，需要的DNA浓度更高。,人工接头连接,连接子（linker）是指人工合成的一段双链寡核苷酸，其中包含一个（或两个）酶切位点。首先将接头与目的DNA片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。,加插头连接,插头（adaptor，又叫适配子）与接头的区别在于其一侧末端是一个粘性末端（内含限制性内切酶位点），而另一侧为平末端，也可以是粘末端。将其与目的DNA片段进行平端或粘端连接后，即可直接与载体连接。,通过PCR获得粘末端,PCR技术的出现大大方便了基因的克隆。在进行PCR时，可根据载体上的克隆位点设计PCR引物，使引物上带有与载体克隆位点相匹配的限制性内切酶识别序列，通过PCR或RTPCR直接产生可用于重组的外源基因片段。,T-A克隆,TaqDNA聚合酶扩增目的DNA同时，在其末端加两个游离的“A”只要载体切口处人工加上游离的“T”，PCR产物即可与载体连接。,五、重组DNA导入受体细胞,目的基因与载体在体外重组后应导入受体细胞中才能扩增并进一步筛选。转化（transformation）将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程。感染（infection）以噬菌体粘性质粒和真核病毒作载体构建的重组分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或嗜菌体颗粒，感染适当细胞并在细胞内扩增的过程。还有一个易混淆的名称是转导（transduction），它是指细菌基因被一个噬菌体从一个细菌转移到另一个细菌的过程。转染（transfection）是由转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。,基因工程中的受体细胞又叫宿主细胞，分为两类：原核细胞（如大肠杆菌、枯草杆菌等）和真核细胞（如酵母细胞、哺乳动物细胞及昆虫细胞等）。1、容易接纳重组分子。2、对载体的复制扩增无严格限制。3、不存在特异的内切酶降解外源DNA。4、不对外源DNA进行修饰。5、还需根据选用的载体及其所具备的筛选标记。如质粒pBR322用氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）作筛选标记，受体细胞则用对Amp和Tet敏感的大肠杆菌HB101细胞。,将外源DNA导入靶细胞的方法很多，应根据实验目的、受体细胞种类、外源基因大小等不同来选择。导入方法大致分为三类化学方法：如CaCl2转化法、磷酸钙共沉淀法。在磷酸钙DNA共沉淀方法中将被转化的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，通过内吞作用进入受体细胞。另外还有DEAE葡聚糖转化法等。物理方法：如电脉冲介导法、显微注射法、基因发射枪一类的颗粒轰击技术等。在转基因动物实验中，对体积较大的受精卵细胞或胚胎干细胞，可将目的基因重组体通过微吸管直接注射入细胞核，即显微注射法，此法需要精密仪器及高超技术。生物方法：包括原生质融合法、脂质体介导法，以及噬菌体的体外包装感染法和逆转录病毒和DNA病毒介导的转染法。其中重组逆转录病毒和重组DNA病毒（如腺病毒）转染受体细胞目前常应用于遗传疾病或肿瘤的基因治疗中。,基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，使其提高基因导入细胞的效率。例如用低温CaCl2（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理的、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞”（competent cell）。,感受态细胞,Ca2+诱导的完整细胞的转化（大肠杆菌，革兰氏阳性）1970年建立了此技术，其原理是与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩作用，使细胞出现空隙，细菌这时的状态就是感受态。,六、阳性克隆的筛选与鉴定,通过转化、感染、转染等方式，重组体DNA分子被导入受体细胞，经适当涂布的培养基培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。因为每一重组体只携带某一段外源基因，而转化或转染时每一受体菌又只能接受一个重组体分子，所以设法将众多的转化菌落或噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含的重组DNA分子确实带有目的基因，即可得到目的基因的克隆，这一过程即为筛选（screening）。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取不同的筛选方法。,遗传表型改变筛选法,如果克隆载体携带有某种抗药性标志基因，如Ampr或Tetr，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗生素的培养板上生存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，如插入Tetr内，使标志基因Tetr失活，阳性重组子则不能在含有Tet的培养板上生长。用插入失活筛选的重组子载体往往带有另一个抗生素抗性基因如Ampr，因此可以通过双抗生素对照筛选，即阳性转化子可以在含Amp的培养板上生长而不能在含Tet的培养板上生长。显色反应-蓝白斑实验 当然，非目的基因插入的载体或自身环化的载体导入的受体菌也能在含抗生素的培养板上生长，造成假阳性克隆，因此抗菌标志筛选只能是初筛（噬菌体载体转化菌形成的噬菌斑也可以进行初筛），还需要进一步确定重组体是否含有目的基因。,双抗生素对照筛选,电泳筛选法,直接提取重组DNA进行核酸凝胶电泳。DNA的电泳迁移率与其分子量的大小成反比。因此那些带有外源DNA的重组体分子量大于空载体DNA，在凝胶中“跑得慢”。另外用不同的限制性内切酶切割重组DNA，分析酶切图谱，也可进一步验证阳性克隆。,分子杂交法筛选,核酸分子杂交广泛应用于鉴别阳性重组体、筛选基因、确定DNA同源性、研究基因定位等，是现代分子生物学和基因工程中最基本、最重要的技术之一。主要方式是将待杂交的核酸分子固定在适当的支持物上，用放射性标记或生物素等非放射性标记的探针与被固定的分子杂交，以检测目的DNA或RNA分子存在与否及其位置等。,将转化后得到的菌落或噬菌斑原位转移到硝酸纤维素滤膜（nitrocellulose filter membrane，NC膜）上，得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品。原位裂解细胞，碱变性，核酸分子被固定于膜上。然后加入标记的DNA或RNA探针进行杂交。凡是含有与探针互补序列的菌落或噬菌斑经放射自显影或显色底物处理后，就会在X光底片上出现杂交点或在NC膜上显色。根据阳性反应位置，可从保留的母板上挑出所需的克隆,菌落（噬菌斑）原位杂交（In situ hybridization）,Southern杂交（Southern blot）,由Southern于1975年发明，故命名。可用于进一步验证目的DNA片段是否插入载体或整合于细胞染色体中。基本程序是提取重组DNA或基因组DNA，用适当的限制性内切酶消化后，用凝胶电泳将DNA片段按其大小分开;碱变性后转移到NC膜上，然后与标记的DNA或RNA探针进行杂交。同样，凡是含有与探针互补序列的DNA片段经放射自显影或显色底物处理后，就会在X光底片上出现杂交带或在膜上显色,斑点杂交（Dot blot）与Southern杂交的不同之处只在于被检测的DNA不经电泳分离，直接点在NC膜上用于杂交分析。,免疫学筛选方法,免疫学筛选是利用特异抗体与目的基因表达的抗原产物相互作用进行筛选，特异性和敏感性也较高，尤其适用于筛选不为宿主菌提供任何选择标记的基因，或者是已获得了该基因编码的蛋白质产物的多克隆或单克隆抗体，用这些抗体来检测目的基因表达的产物。,免疫学方法很多，如Western blot，还有免疫化学方法、酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫沉淀、免疫荧光抗体技术等，可对目的基因表达的蛋白进行定性，甚至定量检测。,Western blot的被测物是目的基因所表达的蛋白质。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后的样品转移到NC膜上，将印有蛋白条带的NC膜依次与目的蛋白的特异抗体、酶标记或同位素标记的第二抗体反应，然后用底物显色或放射自显影来检测蛋白区带的信号。Western blot检测蛋白质特异性和敏感性高，可检测出ng水平的蛋白质。,聚合酶链反应（PCR）筛选 外源基因插入载体后，可根据外源基因两侧载体序列或直接利用目的基因5 端和3 端序列设计引物，以提取的重组DNA为模板进行PCR扩增，看是否能扩出目的基因片段，进而筛选阳性克隆。,DNA序列测定 DNA序列测定是验证插入载体中的外源基因是否正确的最确凿证据，也是筛选的最后一步，往往在基本确定阳性克隆后再测序。目前，DNA测序已高度自动化，所依赖的基本技术原理一是Allan Maxam和Walter Gilbert创建的化学裂解法，二为Frederick Sanger建立的双脱氧末端终止法。,基因克隆的基本步骤,粘性末端,质粒,目的基因,粘性末端,匹配的粘性末端,酶切后的目的基因片段,接(连接),连接后的重组质粒DNA分子,大肠杆菌,转(转化),染色体,真好玩!,筛(筛选),分解抗生素的酶,含抗生素的培养基,还活着!,玩完啦!,大肠杆菌,大肠杆菌,大量生长,提取大量质粒,酶切鉴定,您已经掌握基因克隆的主要步！,分离目的基因和载体DNA。用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。连接酶将目的基因装入载体。转入细菌。筛选具有抗药性克隆。,