凋亡相关基因Bax表达产物的检测.ppt

凋亡相关基因Bax的表达产物的检测,实验（三),实验原理,免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。,链霉亲和素生物素过氧化酶复合物技术（SABC技术）,其特点是利用链霉亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。链霉亲和素对生物分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍，其对组织和细胞的非特异吸附很低，该方法背景很低。SABC大约可以形成一百万个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物SABC具有很高的敏感性、低背景和操作简便的优点。,SABC,(avidin-biotin-peroxidase complex),antigen,器材与试剂,仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜、湿盒 材料：培养细胞 试剂：甲醇、PBS、封闭液、一 抗、二抗、SABC、DAB、0.3H2O2-PBS DMEM培养液（10%小牛血清的高糖、无糖）顺铂（20、40umol/l）,试 剂说明,PBS：磷酸盐缓冲液（0.01M，PH7.2）封闭液：5%牛血清白蛋白（BSA，即用型）一 抗：小鼠IgG（抗小鼠、抗大鼠、抗人），用时PBS稀释 二抗：山羊抗小鼠IgG(生物素化)SABC(avidin-biotin-peroxidase complex)：链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物 DAB(diaminobenzidine)显色液试剂盒：（3,3-二氨基联苯胺、TBS、H2O2）,课前操作,周二下午接种细胞 96孔板（每组8孔）正常、缺糖损伤、两浓度药物损伤各2孔周三中午损伤（6孔）周四中午固定、加封闭液（正常、缺糖损伤、两浓度药物损伤各1孔，共4孔），30分钟后加一抗周五中午加二抗,实验步骤,培养细胞（96孔板，每组正常、缺糖损伤、两个浓度药物损伤各2孔）吸弃培养液，PBS洗，3次(轻轻摇动后吸弃，小心)甲醇固定5minPBS洗，3次（同上）（加时用吸管，吸时用枪，以后同）加入封闭液25l，37，30min，吸去上清液加一抗25l，37，1-2h后置4冰箱过夜(每组各3孔)PBS洗，3次加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10l）25l，37，1hPBS洗，3次,实验步骤,加0.3 H2O2-PBS（30-50l），37，30minPBS洗，3次SABC工作液（即用型）25l，37，30minPBS洗，3次DAB显色：DAB显色工作液配制（现配）：用三蒸馏水稀释DAB显色液（20倍），混匀后加至96孔板（25-30l/孔），镜下控制，以蒸馏水终止反应。观察结果,实验结果,缺糖前 HeLa 细胞,缺糖 24h HeLa细胞,缺糖 48h HeLa 细胞,缺糖前 PC 12细胞,缺糖 24 h PC 12细胞,缺糖 48 h PC 12细胞,注意事项,吸弃及加液时要注意不要将细胞吹起一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度有直接关系。染色时间要控制好，及时以蒸馏水终止反应，以免染色太深影响观察,下次实验内容,家系分析、传代细胞染色体标本的制备,