公共场所卫生监测微生物检验技术(2014版).ppt

公共场所卫生监测微生物检验技术,公共场所卫生技术服务机构承担的工作,（一）空气、微小气候（湿度、温度、风速）、采光、照明、噪声等室内环境的卫生检验、检测与评价；（二）顾客用品用具的卫生检验、检测与评价；（三）游泳场（馆）和公共浴室水质卫生检验、检测与评价；（四）公共场所饮用水（包括：自备水、直饮水、二次供水）卫生检验、检测与评价；（五）集中空调通风系统的卫生检验、检测与评价。,2013年公共场所卫生监测微生物指标,生活饮用水 生活饮用水标准检验方法(GB/T 5750)宾馆微生物指标 公共场所卫生标准检验方法（GB/T 18204-2000）游泳池水微生物指标 公共场所卫生标准检验方法（GB/T 18204-2000）集中空调系统微生物指标 公共场所集中空调通风系统卫生规范（WS 394-2012）,公共场所生活饮用水微生物检验,指标：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫、隐孢子虫,生活饮用水中微生物指标,名称 单位 限值菌落总数 CFU/mL 100 总大肠菌群 MPN/100mL或 CFU/100mL 不得检出 耐热大肠菌群 MPN/100mL或 CFU/100mL 不得检出 大肠埃希氏菌 MPN/100mL或 CFU/100mL 不得检出 贾第鞭毛虫 个/10 L 1 隐孢子虫 个/10 L 1,水样的采集和保存,采样的原则:1.采集的水样，必须具有代表性，能真实反映水质状况。2.在实验室检测之前水样中微生物数量应保持不变。,采样容器,1.采样容器应采用洁净、无色、无毒的硬质玻璃（又称硼硅玻璃）。样品瓶必须专瓶专用，切不可用实验室盛装过浓溶液的瓶作采样瓶。通常我们使用500ml的高压灭菌的细口瓶采样。2.容器及瓶塞、瓶盖应能经受灭菌的温度。,3.容器洗涤：将容器用自来水和洗涤剂洗涤，并用自来水彻底冲洗后，用10%盐酸溶液浸泡过夜，然后依次用自来水，蒸馏水洗净。4.容器灭菌：分干热和高压蒸气灭菌两种。干热灭菌要求160下维持2 h；高压蒸气灭菌要求121下维持15 min，高压蒸汽灭菌后的容器如不立即使用，应于60将瓶内冷凝水烘干。灭菌后的容器应在2周内使用。,水样采集,单独采样。同一水源、同一时间采集几类检测指标的水样时，应先采集供微生物学指标检测的水样。采样时应直接采集，不得用水样涮洗已灭菌的采样瓶，并避免手指和其他物品对瓶口的沾污。末梢水采集：采样前用酒精灯灼烧对水管口进行消毒，放水约5分钟后采集水样约玻璃瓶的80%。容积整个过程要快，稳。不要让水流过大，以免溅出，管口不要与瓶口接触，收集完应马上将瓶塞旋紧。,水样保存方法,黑暗处，4，4h内检测。如有游离余氯应在采样瓶消毒前每125ml加0.1mg硫代硫酸钠溶液(10%)。,菌落总数检测方法,1.平皿计数法本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定。,菌落总数,指在一定条件培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等)，1mL水样中所含菌落的总数。,检验步骤,生活饮用水以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1 mL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15 mL已融化并冷却到45左右的营养琼脂培养基，立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36培养箱内培养48 h，进行菌落计数。即为1mL水样中的菌落总数。,水源水,以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入盛有9 mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1:10稀释液。吸取1:10的稀释液1 mL注入盛有9 mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1：100稀释液。按同法依次稀释成1：1 000，1：10 000稀释液筹备用。如此递增稀释一次，必须更换一支1 mL灭菌吸管。用灭菌吸管取未稀释的水样和2个3个适宜稀释度的水样1 mL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。,菌落计数及报告方法,菌落计数方法：先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5 倍10 倍的放大镜检查，以防遗漏。两个平板若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。,不同稀释度的选择及报告方法,首先选择平均菌落数在30300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时,则将该菌落数乘以稀释倍数报告之。若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均效。若大于或等于2则报告其中稀释度较小的菌落总数。若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之。,如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm2中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积63.6，再乘其稀释倍数作报告。菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表1“报告方式”栏）。,总大肠菌群,定义：一群在36条件下培养2448小时能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群是卫生学上的概念，不是细菌分类学概念，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。主要包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等的细菌。,卫生学概念,总大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。人、畜粪便对外界环境的污染是总大肠菌群在自然界存在的主要原因。但它也来自植物的土壤，它所包括的微生物在地面水中也可繁殖。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以总大肠菌群其他型别较多。,多管发酵法,本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。总大肠菌群检测比较简单，所以被广泛用做水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标。也是评价生活饮用水卫生质量的重要指标之一。,EMB分离培养,将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36 l 培养箱内培养18h24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落。,镜 检,复发酵,结果报告,根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN（most probable number，最可能数）检索表，报告每1 00 mL水样中的总大肠菌群最可能数(MPN)值。稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出（注意稀释度）。,耐热大肠菌群计数,定义：在44.5培养24h48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。是大肠菌群的一个亚群，主要是埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属。它很少在地面水中繁殖，且仅来源于人和温血动物的粪便，因此其卫生学意义更大，检出之表明饮水已被粪便污染，有可能有肠道致病菌和寄生虫等病原体的危险。,大肠埃希氏菌,定义：大肠埃希氏菌广泛存在于是人和温血动物的肠道中，能够在44.5发酵乳糖产酸产气、IMViC生化试验为+-或-+-大肠埃希氏菌主要是用于指示水源近期受到粪便污染。该指标与粪便污染的相关性好,检验方法,多管发酵法总大肠菌群多管发酵法初发酵检测阳性管，用接种环挑一环到EC-MUG管中，44.5培养24h2h，用366nm紫外灯照摄，产生兰色荧光者为阳性,酶底物法,大肠埃希氏菌产生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase）分解四甲基伞形酮-D-葡萄糖苷（4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide，MUG）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠埃希氏菌。定性试验、定量试验（10管法、51孔定量盘法）培养基：EC-MUG黄色有蓝色荧光者为阳性水样不变黄有蓝色荧光者不属于阳性,公共场所卫生检验、检测与评价,公共场所空气细菌总数测定(GB/T 18204.1-2000)茶具、毛巾、床上卧具等公共用品的细菌总数和大肠菌群,公共场所空气细菌总数检验方法（GB/T 18204.1-2000）,撞击法：将集菌的营养琼脂平板置361培养48h，计数菌落数。自然沉降法：将已采样平板置361培养48h，计数每块平板上菌落数，求出全部采样点的平均菌落数。,公共场所空气细菌总数结果报告,撞击法 计算公式：细菌总数=平皿菌落数/（采样器流量*采样时间）结果单位：cfu/m3 自然沉降法 计算公式：细菌总数=平均每皿菌落数 结果单位：cfu/皿,茶具细菌总数检验方法（GB/T 18204.2-2000）,采样：用灭菌生理盐水湿润棉拭子，在茶具与口唇接触的内外缘涂抹50cm2，既1-1.5cm高处一圈。用灭菌剪刀剪去棉签手接触的部分，将棉拭子放入10mL生理盐水内，4h内送检。此液作为1:10,茶具细菌总数检验方法,将采来的1:10样品涂抹液（棉拭子涂抹）充分混匀，再取1:10样液1mL于9mL的NS中充分混匀为1:100样液。两稀释度各吸样液于两个平皿中，每皿1mL。最后注入营养琼脂，置361培养48h计数菌落数。同时做空白对照。,茶具细菌总数结果报告,计算公式：细菌总数=平均菌落数*稀释倍数/50单位：cfu/cm2,茶具大肠菌群检验方法（GB/T 18204.3-2000）,茶具大肠菌群检验,发酵法：取测定茶具菌落总数剩余样品，倒入双料乳糖胆盐发酵溶液中，置37培养箱内培养24 h后进行观察。阴性报告。阳性进一步接种EMB、乳糖发酵管。纸片法：用灭菌生理盐水湿润5 cm5 cm大肠菌群快速检测纸片两张，分别粘贴在茶具内、外缘口唇接触处，约30 S后取下，置于无菌塑料袋内。置37培养箱内培养24 h后进行观察。结果报告,茶具大肠菌群发酵法检验步骤,推测性试验：将测定细菌总数剩余的检样倒入双料乳糖胆盐发酵液中，置361培养24h观察结果。证实试验：自推测性试验阳性管中取一接种环培养液，接种EMB平板上，置361培养24h观察结果。挑取可疑菌落染色镜检，同时接种乳糖发酵管做复发酵试验，361培养24h观察结果。,茶具大肠菌群纸片法检验步骤,将已采样的大肠菌群测定纸片置361培养1618h观察结果。结果判定：若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。,毛巾、床上卧具细菌总数检验方法（GB/T 18204.4-2000）,涂抹法：25 c(5 cm 5 cm)面积范围;床单、被单在上下两部各25 c面积范围内有顺序地来回涂抹，将棉拭子放人10 mL生理盐水内，4h内送检戳印法,毛巾、床上卧具细菌总数涂抹法检验步骤,将采来的1:10样品涂抹液（棉拭子涂抹）充分混匀，再取1:10样液1mL于9mL的NS中充分混匀为1:100样液。两稀释度各吸样液于两个平皿中，每皿1mL。最后注入营养琼脂，置36培养48h计数菌落数。同时做空白对照。,毛巾、床上卧具细菌总数结果报告,计算公式：细菌总数=平均菌落数*稀释倍数/2单位：cfu/25cm2,毛巾、床上卧具大肠菌群检验方法（GB/T 18204.5-2000）,发酵法纸片法,采样,涂抹法：用测定细菌总数时采集的样品，无需重采。纸片法：用灭菌生理盐水湿润5 cm 5 cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别粘贴在毛巾、床上卧具规定部位和面积范围内，约30 s后取下，置于无菌塑料袋内。培养。,毛巾、床上卧具大肠菌群发酵法检验步骤,推测性试验：将测定细菌总数剩余的检样倒入双料乳糖胆盐发酵液中，置361培养24h观察结果。证实试验：自推测性试验阳性管中取一接种环培养液，接种EMB平板上，置361培养24h观察结果。挑取可疑菌落染色镜检，同时接种乳糖发酵管做复发酵试验，361培养24h观察结果。,毛巾、床上卧具大肠菌群纸片法检验步骤,将已采样的大肠菌群测定纸片置361培养1618h观察结果。结果判定：若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。,理发用具微生物检验方法-金黄色葡萄球菌测定,指在BaurdParker培养基或血平板培养基上生长良好，分解甘露醇产酸；血浆凝固酶阳性的革兰氏阳性葡萄球菌。菌落直径为2 3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。,金黄色葡萄球菌检测,取大肠菌群检测后剩余的5 mL待检样品，放入45 mL7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基中，361增菌24 h。分离于P-k培养基（或用血平皿），36124 h。挑取典型菌落作涂片镜检、甘露醇发酵试验和血浆凝固酶试验,公共场所拖鞋微生物检验方法-霉菌和酵母菌测定,指在一定条件培养后，50cm2面积检样中所含有的霉菌和酵母菌落数。霉菌和酵母菌主要作为判定被检样品被霉菌和酵母菌污染程度的标志，以便对被检样进行卫生学评价时提供依据。,将无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水，在每只拖鞋鞋面与脚趾接触处5 cm5 cm面积上，有顺序地均匀涂抹3次（一双拖鞋为一份样品）后，用灭菌剪刀将棉拭子手执部分剪断，将棉拭子放入10 mL装有玻璃珠的无菌盐水管中。将盛有棉拭子的盐水管在手心用力振荡100次，再用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。此液为1:10稀释液。依次做10倍递增稀释，根据样品的污染情况，选择3个合适的稀释度。将溶化并冷却至45左右的培养基注入灭菌的平皿中，待琼脂凝固后，倒置于2528温箱中，3天后开始观察，共培养观察一周。,游泳池水微生物指标,细菌总数大肠菌群,游泳池水细菌总数检验方法（GB/T 18204.9-2000）,取样液到2只平皿中，每皿1mL；另取样液1mL到9mL灭菌生理盐水中作1：10稀释，取稀释液到2只平皿中，每皿1mL。最后注入营养琼脂置36培养48h计数菌落数。同时做空白对照。,游泳池水细菌总数结果报告,计算公式：细菌总数=平均菌落数*稀释倍数单位：cfu/mL,游泳池水大肠菌群检验方法（GB/T 18204.10-2000）,发酵法滤膜法,游泳池水大肠菌群发酵法检验步骤,推测性试验：在2个装有50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管内各加入100mL水样，在10支装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管内各加入10mL水样，36培养24h观察结果。证实试验：自推测性试验阳性管中取一接种环培养液，接种EMB平板上，置36培养24h观察结果。挑取可疑菌落染色镜检，同时接种乳糖发酵管做复发酵试验，36培养24h观察结果。,游泳池水大肠菌群滤膜法检验步骤,水样过滤，滤膜截留细菌面向上，贴紧乳糖琼脂分离培养基，置36培养24h观察结果。典型菌落染色镜检挑取可疑菌落染色镜检，同时接种乳糖发酵管做复发酵试验，36培养24h观察结果。,集中空调系统微生物指标,送风中细菌总数、真菌总数、-溶血性链球菌风管内表面细菌总数、真菌总数冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌,送风中细菌总数检验方法（WS 394-2012 附录D）,送风中细菌总数：集中空调通风系统送风中通过六级筛孔空气撞击式采样器采集的样品，计数在营养琼脂培养基上经3537、48h培养所形成的菌落数。以每立方米空气中菌落形成单位（CFU/m3）报告。,送风中真菌总数检验方法（WS 394-2012 附录E）,送风中真菌总数：集中空调通风系统送风中通过六级筛孔空气撞击式采样器采集的样品，计数在沙氏琼脂培养基上经28、5d培养所形成的菌落数。以每立方米空气中菌落形成单位（CFU/m3）报告。,送风中-溶血性链球菌检验方法（WS 394-2012 附录F）,送风中-溶血性链球菌：集中空调通风系统送风中通过六级筛孔空气撞击式采样器采集的样品，计数在血琼脂培养基上经3537、24h48h培养所形成的典型菌落数。以每立方米空气中菌落形成单位（CFU/m3）报告。,风管内表面微生物检验方法（WS 394-2012 附录I）,风管内表面微生物检测主要包括细菌总数和真菌总数。采样面积：每一点采样面积应为50cm2。采样方法：空调风管内表面积尘较多时用刮拭法采样，积尘较少不适宜刮拭法采样时用擦拭法采样。整个采样过程应无菌操作。为避免人工采样对采样环境的影响，宜采用机器人采样。,风管内表面微生物检验方法（WS 394-2012 附录I）,刮拭法：将采集的积尘样品无菌操作称取1g，加入到0.01%Tween-80水溶液中，做10倍梯级稀释，取适宜稀释度1mL倾注法接种平皿。擦拭法：将擦拭物无菌操作加入到0.01%Tween-80水溶液中，做10倍梯级稀释，取适宜稀释度1mL倾注法接种平皿。,风管内表面细菌总数检验方法（WS 394-2012 附录I）,风管内表面细菌总数：向接种好样液的平皿倾注营养琼脂培养基，经3537、48h培养，计数菌落数。以每平方厘米表面积中菌落形成单位（CFU/cm2）报告。,风管内表面真菌总数检验方法（WS 394-2012 附录I）,风管内表面真菌总数：向接种好样液的平皿倾注沙氏琼脂培养基，经28、5d培养，计数菌落数。以每平方厘米表面积中菌落形成单位（CFU/cm2）报告。,冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法（WS 394-2012 附录B）,用培养法定性测定集中空调系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中的嗜肺军团菌，其他洗浴水、温泉水、景观水等样品中的嗜肺军团菌测定可参照执行。嗜肺军团菌：样品经培养在GVPC琼脂平板上生成典型菌落，并在BCYE琼脂上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCY琼脂平板不生长，进一步经生化试验和血清学试验鉴定确认的菌落。,采样,采样位置：冷却水距离塔壁20cm，液面下10cm；冷凝水排水管、冷凝盘处。采样量500mL,检验步骤,一、样品沉淀、离心、过滤二、样品处理：1、样品的热处理，1mL洗脱样品，50水浴30min。2、样品的酸处理，5mL洗脱样品调pH值2.2，混匀5min,检验步骤,三、样品的接种、培养：GVPC平板，35-37，2.5%CO2培养10天。第三天，阳性标本能够出现白色、灰色，整齐，表面光滑，成典型毛玻璃状。四、鉴定：BCYE培养：生长；BCY培养：未生长。满足上述菌落进行生化及血清学鉴定。氧化酶-/(+),硝酸盐还原-，尿素-，明胶液化+，水解马尿酸。用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。,谢 谢！,