光学检测技术-张静.ppt

第六章 光学检测技术,利用物质所具有的各种光学性质，对物质进行定性、定量及结构分析的技术。包括：旋光检测、荧光检测、分光光度检测、散射光谱检测等。生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、荧光检测,第一节 旋光检测技术,利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）对偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术。旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋光度。左旋（），右旋（）。物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此外与入射光的波长及温度有关，对溶液而言，还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关系。,旋光法：应用旋光仪测量旋光性物质的旋光度以确定其含量的分析方法。,旋光度和比旋光度是旋光性物质的主要物理性质。通过旋光度和比旋光度的测定，可以检查光学活性化合物的纯度，也可以定量分析有关化合物溶液的浓度。,光是一种电磁波，即光波的振动方向与其前进方向互相垂直。自然光有无数个与光的前进方向互相垂直的光波振动面。若光线前进的方向指向我们，则与之互相垂直的光波振动平面可表示为如图（a），图中箭头表示光波振动的方向。若使自然光通过尼科尔棱镜，由于振动面与尼科尔棱镜的光轴平行的光波才能通过尼科尔棱镜，所以通过尼科尔棱镜的光，只有一个与光的前进方向互相垂直的光波振动面，如图（b）。这种仅在一个平面上振动的光叫偏振光。,自然光与偏振光,通常用以下两种方法产生偏振光：尼科尔棱镜或偏振片。尼科尔棱镜 一块方解石的菱形六面体末端的表面磨光，使镜角等于68，将之对角切成两半，把切面磨成光学平面后，再用加拿大树胶粘起来，便成为一个尼科尔棱镜。其中非常光线MP由方解石到加拿大树胶是由光疏介质到光密介质，必将发生折射通过加拿大树胶，由棱镜的另一端面射出，从而产生了平面偏振光。,偏振光的产生,尼科尔棱镜示意图,偏振片 利用偏振片也能产生偏振光。它是利用某些双折射晶体（如电气石）的二色性，即可选择性吸收寻常光线，而让非常光线通过的特性，把自然光变成偏振光。,分子结构中有不对称碳原子，能把偏振光的偏振面旋转一定角度的物质称为光学活性物质。许多食品成分都具有光学活性，如单糖、低聚糖、淀粉以及大多数的氨基酸和羟酸等。其中能把偏振光的振动平面向右旋转的，称为“具有右旋性”，以（十）号表示；反之称为“具有左旋性”，以（一）号表示。,旋光性、旋光性物质,旋光度,偏振光通过光学活性物质的溶液时，其振动平面所旋转的角度叫做该物质溶液的旋光度，以表示。旋光度的大小与光源的波长、温度、旋光性物质的种类、溶液的浓度及液层的厚度有关。对于特定的光学活性物质，在光源波长和温度一定的情况下，其旋光度与溶液的浓度c和液层的厚度L成正比。即：,KcL,比旋光度,当旋光性物质的浓度为 100 g/100 ml，液层厚度为 l dm（分米）时所测得的旋光度称为比旋光度，以 表示。由上式可知：K11K 即：式中：比旋光度，度；t 温度，光源波长，nm；旋光度，度；L液层厚度或旋光管长度，dm；c溶液浓度，gml。,比旋光度与光的波长及测定温度有关。通常规定用钠光D线（波长 589.3nm）在20时测定，在此条件下，比旋光度用 表示,因在一定条件下比旋光度 是已知的，L为一定，故测得了旋光度就可计算出旋光质溶液中的浓度c。,变旋作用,定义 具有光学活性的还原糖类（如葡萄糖，果糖，乳糖、麦芽糖等），在溶解之后，其旋光度起初迅速变化，然后渐渐变得较缓慢，最后达到恒定值，这种现象称为变旋作用。,这是由于有的糖存在两种异构体，即型和型，它们的比旋光度不同。这两种环型结构及中间的开链结构在构成一个平衡体系过程中，即显示出变旋光作用。,变旋现象,因此，在用旋光法测定蜂蜜，商品葡萄糖等含有还原糖的样品时，样品配成溶液后，宜放置过夜再测定。若需立即测定，可将中性溶液（pH=7）加热至沸，或加几滴氨水后再稀释定容；若溶液已经稀释定容，则可加入碳酸钠干粉至石蕊试纸刚显碱性。在碱性溶液中，变旋光作用迅速，很快达到平衡。但微碱性溶液不宜放置过久，温度也不可太高，以免破坏样品。,旋光仪,WXG型半荫旋光仪检糖计WZB自动旋光仪,WGX型半荫旋光仪,结构和原理 起偏棱镜一般用尼科尔（Nicol)棱镜，以获得偏振光。旋光管盛装待测液的玻璃管。检偏棱镜仍用尼科尔（Nicol)棱镜，用以检测从旋光管射出的偏振光振动平面与原来相比较的角度（可由刻度盘上的数值读出）。,检糖计 检糖计专用于糖类的测定。故刻度数值直接表示为蔗糖的百分含量（W/V），其测定原理与旋光计相同。在结构上有以下特点,检糖计的基本光学元件,自动旋光仪,当检测池中放进存有被测溶液的试管后，由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋转了一个角度，零度视场便发生了变化，转动检偏镜一定角度，能再次出现亮度一致的视场。这个转角就是溶液的旋光度，测得溶液的旋光度后，就可以求出物质的比旋度。根据比旋度的大小，就能确定该物质的纯度和含量了。,旋光法测定味精浓度,样品溶液配制精确称取味精样品10.00g，加4050mL蒸馏水溶解，搅拌加入分析纯盐酸16mL，使味精全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至100mL。旋光仪调零预热10min，放进滤光片。取16mL分析纯盐酸蒸馏水定容至100mL。装满旋光管，调整零点。样品液测定样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，测定旋光度，记录温度。,物质被辐射能照射后，分子内部获得外源能量，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，转变成激发态分子能级，使分子处在高能域不稳定状态，因此，它必须释放多余的能量，变成稳定状态的分子。分子发光：由激发态能级回到基态能级的过程中以光的形式释放多余的能量，并发射出比原波长更长的光谱。荧光分光光度法：检测分子发射光谱的分析方法。,第二节 荧光检测技术,一、特点,专一性强灵敏度高：测定同样浓度物质的含量，通常比吸收光谱灵敏度高24个数量级左右。选择性强：既可分析发射光谱，也可分析激发光谱，偏振光谱。发光方式多：物理发光，化学发光，生物发光。可分析参数多：可分析荧光光谱，荧光强度，荧光效率，荧光寿命等多种物理参数。,二、方法原理,荧光现象：是一种发光现象，当一种波长的光照射在某一荧光物质时，该物质被激发,若能在极短的时间内发射出较激发波长更长波长的光,在激发态停留的时间大约10-810-4s.发射的光谱称为荧光光谱.磷光光谱:若这种光在激发态停留较长的时间,即在激发态停留的时间大约是10-410s,系统内发射出比荧光波长更长波长的光.发射的光谱称为磷光光谱.,荧光产生机理（1）分子能级：最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的基础。分子吸收能量后，电子跃迁到哪一个能级并不重要，重要的是吸收了能量的分子经过内转移以后，将能量降到最低第一级电子激发态振动能级后，能否以光子的形式释放能量，如能就会发射荧光，否则不会。,（2）耗能方式:产生荧光:分子内在因素和外在条件决定.在同一能级中分子间的相互碰撞消耗能量;无辐射衰减转给周围分子变成振动能消耗;辐射荧光-以光子的形式释放能量;光分解消耗分子内部的能量(光分解以产生热的方式，使物质结构发生变化，发光基团的发光能量减弱或丧失).,（3）能量的传递途径:处于较高能级的激发态电子回到基态途径,当两个电子能级非常靠近以致其振动能级发生重叠时，电子由高能级以无辐射跃迁方式转移给低能级,不同多重态间的无辐射跃迁，如S1T1。有时通过热激发，就有可能发生T1 S1，然后产生延迟荧光,被激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用把多余的能量转移给周围分子，使荧光或磷光发射的强度减弱或消失。也称荧光熄灭或猝灭,激发态分子把多余的振动能量以热的形式转给周围分子，而自身从Sn的较高振动能级层降低到该电子能级的最低振动能级层上,处于第一激发单重态最低振动能级的电子回到基态振动能级时，在短时间内发射一个光子返回到基态,分子的系间窜跃跃迁后，就会发生快速的振动弛豫到达第三激发单重态最低振动能级上，以光子的形式跃迁回到基态,（4）分子荧光的类型:根据荧光物质所需的激发光源不同和吸能后发射荧光光谱的差异,分为:物理发光(物理/光致荧光）：荧光分子吸收了光能(如以X射线，紫外光，激光等为光源的辐射能等)而产生的荧光;化学发光:通过分子与分子之间的化学反应所产生的化学能，在化学反应过程中释放能量而发射荧光;生物发光:通过生物体内的荧光酶与荧光物质相互作用，在生物化学反应过程中所释放出来的光能.,2.激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物的分子在吸收能量和释放能量的过程中，都存在着激发光谱和发射光谱。激发光谱：荧光分子首先要从外界得到相应的能量，才能具备发光的基本条件,才有可能发射荧光。在选择最佳激发波长时，可通过测量分子的激发光谱来确定。,发射光谱：分子发射荧光的特征波长比吸收的特征波长长。发射光谱的形状与激发光谱极为相似,且呈镜像对称关系。,3.荧光量子产率与分子结构（1）荧光分子产生荧光的条件：荧光分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，能吸收激发光提供的辐射能；分子吸收了与本身特征频率相同能量后，必须具有产生一定的荧光量子的能力。产生荧光量子的强弱可用荧光量子产率（也称荧光效率或量子效率）来表示：,（2）分子结构与荧光的关系：共轭效应：含有-*电子跃迁能级化合物的荧光最强。绝大多数能发射荧光的化合物，都是芳香族或杂环类化合物或者在它们的分子中含有芳香族或杂环类基团。苯类化合物的对苯基化、间苯基化及乙烯化作用能够增强苯分子的荧光强度。,分子的刚性平面结构：能产生较强荧光。这种结构可以减少分子的振动，分子与溶剂或其他溶质分子相互之间的作用降低了，这样更有利于荧光的发射（如芴和联二苯的荧光效率分别为1.0和0.2；荧光素有很强的荧光，而酚酞没有荧光）。,取代效应：给电子基团（如-OH，-OR，-NH2，-CN，-NR等）能使荧光增强，得电子基团（如-COOH，-C=O，-NO2，-NO及卤素离子等）能使荧光减弱,三、仪器的结构与原理,1.荧光分光光度法定量分析基本原理 溶液的荧光强度和该溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的荧光量子效率有关。,2.荧光分光光度计的结构 激发光源,激发单色器,样品池,发射单色器,检测器及显示系统激发光源：要求能发出强度较大，连续稳定的光源。理论上,发射荧光的强度取决于激发光源的强度.实际应用中选择光源的强度不能太强也不能太弱。要根据荧光物质的性质选择合适光源:对光敏感或发射荧光较强的物质选用较弱光源,反之可选较强光源.,测量荧光强度仪器：滤光片荧光分光光度计和结构复杂的精密荧光分光光度计。主要部件：激发光源:前者常用汞灯,后者常用氙灯(250700 nm).滤光片和单色器：前者采用两个滤光片(激发滤光片/荧光滤光片)；后者采用光栅作单色器。样品池：低荧光的玻璃或石英制成，形状以散射光较少的方形为宜。检测器：阻挡层光电池(500600 nm最灵敏)，缺点：易疲劳，灵敏度低；光电倍增管检测器：灵敏度高，使用简单，特别适用于强度微弱光的测量。,四、实验技术（影响荧光分析的因素）,溶液的pH的影响：在溶液中，绝大多数荧光物质都是以离子状态形式存在的，发射荧光的最佳条件是解离的荧光分子。温度的影响:温度升高，荧光物质产生的荧光效率和荧光强度都会下降，反之。溶剂的影响：荧光物质的荧光波峰位置和荧光强度与溶剂的介电常数有关。不同溶剂对各种荧光物质发生荧光的影响程度是不同的，某些溶剂可使荧光物质形成配合物，某些溶剂可改变荧光物质的解离状态。,激发光源的影响：光分解:荧光化合物被强激发光照射会发生分解，引起荧光强度迅速下降。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品池。器皿污染的影响：器皿内壁含极少量荧光物质，会使测定结果造成偏差，最好用30%硝酸清洗。内滤效应的影响：在样品溶液中存在着杂质或测试样品池浓度太大引起荧光变弱的现象。自吸收：样品浓度大，荧光分子吸收光能和发射荧光的同时有部分重叠，而引起可检测的荧光强度变弱。杂质吸收：样品溶液中存在能吸收激发光或发射光能量的杂质，使检测到的光强度变弱。,稀样品溶液的影响:氧化作用：荧光物质的稀溶液不如浓度高的溶液稳定，易发生氧化作用(肾上腺素，1 g/mL，100 g/mL)光分解：稀溶液相对于高浓度溶液更易发生光分解，尤其对光较敏感的物质。表面吸附：某些非待测的荧光物质吸附在比色皿内壁表面上，在分析过程中这些荧光物质发射相应的荧光，干扰测定。对稀溶液影响大。另外，表面吸附对不同溶剂吸附程度不同，有机溶剂表面吸附更明显。,五、荧光检测技术的应用,根据发光机理，能吸收能量后以光子的形式释放能量的化合物都属荧光物质。发光方式分：自荧光物质(分子中含荧光发光基团或化学键)外源荧光物质(要与某些荧光物质或荧光燃料以共价键或离子键的形式结合),分析方法:1、定量分析方法：（1）标准曲线法（2）外标法（直接比较法）：在一定浓度范围内，选择一个合适的标准样品浓度，将其在荧光分光光度计上测得的值与在同样条件下的未知样品的值进行比较，得出未知样品的浓度。未知样品浓度（mg/mL）=(A1/A2)c 式中，A1为未知样品的荧光发光值，A2为标准样品的荧光发光值，c为标准样品浓度。2、定性分析：根据荧光发射的波长和出现的峰位，确定物质结构的某些特征.,第三节 分光光度检测技术,a、目视比色法 用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方法称为目视比色法。特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不高。b、分光光度计,基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。包括：,分光光度检测技术（Chapter two spectrophotography),定义:分光光度检测技术是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。特点:灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。应用:生物化学研究中广泛使用的方法之一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。,分光光度检测的分类,分光光度检测的分类,红外分光光度检测:可见光分光光度检测:紫外分光光度检测:,测定波长范围为大于760 nm的红外光区 测定波长范围为400760 nm的可见光区 测定波长范围为200400 nm的紫外光区,一、分光光度计工作原理,（一）分光光度检测的光谱范围,包括波长范围为400760 nm的可见光区和波长范围为200400 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的400760nm波长的光谱，光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源。氢灯的发射光谱：氢灯能发出185400 nm波长的光谱，可作为紫外光分光度计的光源。,（二）物质的吸收光谱,如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据溶液的吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质。,用不同波长的单色光照射，测定吸光度，如果以波长为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为吸收曲线（A曲线）。,（1）不同物质吸收曲线的形状和吸收波长不同。,MnO4-,531,吸收曲线,（2）同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似。,吸收曲线是特征的，可以提供物质的结构信息，作为物质定性分析的依据之一；吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。入射光=反射光 分散光 吸收光 透过光 如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为“空白”去校正反射、分散等因素造成的入射光的损失，则：入射光=吸收光 十 透过光,(三）分光光度计常用术语,C:测试溶液的浓度 I:透过光的强度 I0:空白校正后入射光的强度 T:透光率（I/I0）A:光吸收（OD）L:比色杯光程,吸光度A：物质对光的吸收程度。定义：Alg（I0/It)A越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。,（四）依据原理：朗伯-比尔定律（Lambert Beer）,1760年朗伯(Lambert)阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：Ab,1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：Ac,二者的结合称为朗伯比耳定律，Abc,朗伯比耳定律数学表达式：,Alg（I0/It)=b c 式中：A，吸光度，无量刚；b，液层厚度(光程长度)，cm；c，溶液的浓度，mol L-1；(epsilon)称为摩尔吸光系数，Lmol-cm-1，仅与入射光波长、溶液的性质及温度有关，与浓度无关。上式表明：当一束单色光通过溶液时，其吸光度与溶液浓度和宽度的乘积成正比。,T、A、c间的关系：A lg（I0/It)=-lg T=b c,透光度(透光率)T：透过光和入射光强度之比，即T=It/I0 100%T越大，表示对光的吸收越小。,朗伯-比尔定律的适用条件,单色光 应选用max处或肩峰处测定.,稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强.,吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等).,吸光度具有加和性：在多组分体系中，吸光度具有加和性，即：A（总）A1+A2+An=1b c+2b c+nb c,(五）分光光度计的基本结构,无论哪一类分光光度计都包括5个基本部件：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示:,分光光度计的基本部件,光 源:分光光度计上常用的光源有两种：钨丝灯或氢灯，在可见光区、近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源；在紫外光区多使用氢灯。单色器：把混合光波分解为单波长光的装置。在分光光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件。吸收池：（比色杯、比色皿、比色池）一般由玻璃、石英或熔凝石英制成，用来盛被测的溶液。在低于350 nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。,吸收池（比色皿）必须与光束方向垂直。此外，每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差。比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使用前务必彻底清洗。,检测器：常用光电池、光电管和光电倍增管三种。测量仪表：一般常用的紫外光和可见光分光光度计有3种测量装置，即电流表、记录器和数字示值读数单元。现代的仪器常附有自动记录器，可自动扫描出吸收曲线。,（六）使用分光光度法测定样品溶液浓度的计算方法,标准曲线法（常用）标准管法 标准系数法 回归分析法,其方法和步骤是：1）配制一组浓度不同的标准溶液(c1、c2)；2）在一定波长下，分别测定其吸光度(A1、A2)。3）以A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制曲线，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线（A-c曲线）。4）用完全相同的方法和步骤测定待测溶液的吸光度Ax，从标准曲线上找出对应的浓度cx值（Ax cx）。,标准曲线法,标准曲线,注意：用比色法测定待测样品时，操作条件应与标准曲线相同,721-分光光度计 1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）3.根据所需波长转动波长选择钮。4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向T=0处。6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的T=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。,（七）显色反应,mX(待测物)nR(显色剂)XmRn(有色化合物)主要有配位反应(为主)和氧化还原反应。,配位显色反应 当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外可见吸收光谱。,氧化还原显色反应,例如：钢中微量锰的测定，Mn2不能直接进行光度测定 2 Mn2 5 S2O82-8 H2O=2 MnO4-+10 SO42-16H+将Mn2 氧化成紫红色的MnO4-后，在525 nm处进行测定。,（八）显色剂,：,：,：,：,助色团：NH，OH，X(孤对电子),O,生色团：NN，NO，,O,C=S,N（共轭双键）,无机显色剂:SCN-Fe(SCN)2+（红色）H2O2 TiOH2O22+,有机显色剂:,OO型：,ON型：,PAR,S型：,双硫腙,NN型：,丁二酮肟,邻二氮菲,磺基水杨酸,有机显色剂,显色反应的选择,*灵敏度高*选择性好*显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。,要求有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。,