《核酸电泳》课件.ppt

核酸物质提取与电泳,天然DNA的制备,总DNA：主要指基因组DNA(genomic DNA)，即细胞核内的染色体DNA分子。,如果将螺旋状的DNA分子拉直，其长度将超过人的身高，这个特点使其对机械力十分敏感。目前可以成功地测出它的一级结构，但仍难以分离出它的完整分子。,特点：一条染色体为一个DNA分子，高等生物核DNA的长度与直径的比值很大，DNA分子呈极不对称的线状结构,1.天然DNA的来源(1)染色体DNA(2)病毒与噬菌体(3)质粒DNA(4)线粒体与叶绿体,2.DNA的提取,细胞的破碎物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法、煮沸破碎法、微波破碎法等；特点：容易导致DNA链的断裂.酶解法：蛋白酶K裂解法（常和SDSCTAB法一起裂解细胞）、溶菌酶裂解法（常和热处理一起裂解细胞）等；化学法：CTAB裂解法、SDS裂解法等等；特点：简单易行；能满足分子生物学研究的需要。,超生波,液氮,总DNA的提取：去除多糖、脂类、蛋白等，添加Rnase降解RNA后得到的就是 DNA,去除多糖：CTAB、PVP、高盐溶液等去除脂类：SDS、CTAB等去除蛋白：SDS、蛋白酶、酚氯仿等,质粒DNA的提取,破坏细胞壁 溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠(SDS),裂解细胞膜 十二烷基磺酸钠(SDS)、Triton X-100,1、蛋白质及其它杂质的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出来高浓度盐离子(KCl)使变性蛋白、多糖、细胞碎屑等沉淀出来,2、细菌线形染色体DNA的去除强热、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性，当快速降温、加入酸中和时，已变性的细菌线性染色体DNA变性不能快速复性，与其它杂质缠绕而沉淀出来质粒DNA双链可快速恢复原状,重新形成超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中,3.DNA的纯化和浓缩,(1)乙醇(2)异丙醇(3)聚乙二醇(PEG600),工作区域应与普通微生物实验的区域隔开！,RNA的提取分离,1.应与进行普通微生物实验的区域分离开2.使用标有“无RNA酶”的商品试管,吸头,溶液和水.（通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶）3.双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理:a、每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37下作用数小时.b、将溶液高压灭菌至少15min使DEPC失活 4.分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300烘烤至少4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理,前期准备:,1.在Trizol试剂的保护下，匀浆组织，静置裂解细胞释放内含RNA，Trizol试剂对RNA有保护作用，能抑制RNA酶的活性，并且同时有裂解细胞的作用。2.将匀浆液中加入苯酚，去除裂解液中的脂类，蛋白和DNA，离心后取出上清液，里面含有RNA，而杂质留在苯酚中3.在上清液中加入等体积异丙醇，混匀后，静置片刻，离心，将RNA沉淀于管底。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，离心。去上清，将沉淀在真空干燥器中烘干,RNA提取关键步骤,核酸电泳Nucleic Acid Gel Electrophoresis,电泳(electrophoresis)：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。,许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下均带有电荷。,凝胶电泳的原理：,电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。（当一种分于被放置在电场当中时、它们就会以一定的速度移向适当的电极）。,1、同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。（电场强度越大电泳分子所携带的净电荷数量越多，迁移的速度越快。反之则较慢）,2、电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。电泳时会使用一种无反应活性的、稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，降低了对流运动。数据表明：摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数,电泳的原理：根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带净电荷的多寡，可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。,19世纪初(1808)发现了电泳现象。当时多用于胶体化学的分析 1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白呈4-5高峰即界面电泳 1948年 Wieland等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化 近30年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术,（一）电泳的分类：1、按分离原理分为：自由电泳 如：显微电泳 区带电泳 稳态电泳（置换电泳）：如等电聚焦和等速电泳 特点：分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态,自由电泳由于设备复杂，操作时间很长，不能完全地分离混合物的各个组成等一些不可克服的缺点，已逐渐为区带电泳所代替,2、按有无固体支持物分类,a、按其支持物的物理性状不同可分为：1)凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉 凝胶电泳 2)滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸纤维膜、聚胺纤维薄膜 3)粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 4)线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳,有支持物电泳的分类,b、按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：1)平板式电泳：最常用，支持物水平放置 2)垂直板式电泳：例如，垂直板聚丙烯酰胺凝胶 3)垂直柱式电泳：例如，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳,3、按pH的连续性不同，区带电泳可分为：(1)连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如 常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等(2)非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同 的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳，等电聚焦电泳等,4、按电泳时的电压分为：,高压电泳 电压：500-1000V 电位梯度：50-200V/cm 特点：分离速度快，但热效应大，需冷却装置 主要适合于小分子化合物的快速分离常压电泳 电压：500V以下 电位梯度：2-10V/cm 特点：分离速度慢，但对设备要求不高 医学、检测、普通科研上常用,1.纸电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.梯度凝胶电泳4.等电聚焦5.毛细管电泳6.琼脂糖凝胶电泳7.聚丙烯酰胺凝胶电泳8.脉冲电泳凝胶电泳,几种经典的和新型的电泳技术：,1、纸电泳,用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术，用来分离：氨基酸、核苷酸、蛋白质和肽类（要求滤纸厚度均匀，常用国产新华滤纸和进口Whatman1号滤纸，点样位置在滤纸一端距纸边5cm10cm处。样品可点成园形或长条形，而以长条形的分离效果较好）,主要用途：分辨率比凝胶介质差，但由于操作简单，现在仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途,2、醋酸纤维薄膜电泳,醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜作为支持介质,特点：.醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带清晰。.快速省时.灵敏度高，样品用量少。.应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。.醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的薄膜，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。,主要用途：分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症的鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术,3、梯度凝胶电泳,采用梯度聚丙烯酰胺凝胶为介质，从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度递增（凝胶的顶部孔径较大，底部孔径较小）。,梯度凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳类似，但具有以下不同特点：分离范围更宽 分辩率更高 可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基,4、等电聚焦电泳,等电聚焦电泳：根据两性物质等电点（pI）不同而进行分离的一种电泳技术，具有极高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离蛋白质等两性物质的一种理想方法分离原理：是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个不连续的pH梯度，两性物质在电泳过程中会自动集中在与其等电点相应的pH区域内，从而得到分离,两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基-多羧基混合物，不同两性电解质具有不同的pH梯度范围等电聚焦通常使用低浓度聚丙烯酰胺凝胶（如4）薄层电泳，以降低成本和防止分子筛作用,5、毛细管电泳,一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术发展于20世纪80年代中后期，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是：(1)所需样品量少、仪器简单、操作简便；(2)分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高；(3)操作模式多，开发分析方法容易；(4)实验成本低、消耗少；(5)应用范围极广,琼脂糖：一种从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质（琼脂糖由1,3连接的吡喃型-D-半乳糖与1,4连接的3,6脱水吡喃型-L-半乳糖组成）。琼脂糖分子呈随机线团状，凝结初期由于氢键的作用形成双链分子，而后再发生双链分子间的连接直至最后固化。由于链间的连接是靠氢键的作用，所以一切会破坏氢键形成的因素都会影响凝胶的形成。,6、琼脂糖凝胶电泳,根据琼脂糖的溶解温度，琼脂糖可以分为：一般琼脂糖 和 低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在 37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等.低浓度的琼脂糖电泳相当于自由界面电泳,本专题（核酸电泳技术）的学习重点,6.1 不同类型琼脂糖的性质,6.2 凝胶介质的分辨能力1)、凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小 浓度越高，孔隙越小，分辨能力越强；浓度降低孔隙就增大，分辨力随之减弱。,2)、凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围：70bp-80kb；而聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力为：6-1000bp。,6.3 不同类型琼脂糖的分辨率,B、凝胶SYBR Gold的染色,SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称 其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号,A、凝胶的EB染色,6.4 凝胶的染色,6.5 凝胶中DNA谱带的成像,可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察,6.6 凝胶中DNA/RNA片段的回收,现一般采用试剂盒回收：存在的主要问题：1、不能有效的回收大片段DNA 2、不能有效回收少量DNA,1.DNA分子质量2.DNA构型 如：质粒 超螺旋DNA线状DNA开环DNA3.胶浓度4.电场强度 一般电压为1-10V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm以下。电泳过程最好 在低温条件下进行。5.EB6.电泳缓冲液7.碱基组成与电泳温度,6.7 电泳时 DNA迁移的影响因素,6.8 三种常用电泳缓冲液及其特点：TAE(Tris-乙酸)、TPE(Tris-磷酸)及 TBE(Tris-硼酸),4）高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。,1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；,2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；,3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%；,7.聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）,注意：丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺具有神经毒性，能够经过皮肤及呼吸道进入体内，会因多次积蓄而中毒；操作时需戴手套和面罩。,网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度,7.1 基本原理,7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)或尿素，或SDS-尿素后，用其作支持物进行(分离检测大分子样品)的凝胶电泳。,1)变性聚丙烯酰胺凝胶,A、该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。,B、变性的DNA在凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及顺序完全无关。,a、单链DNA片段、寡核苷酸片段的分离或纯化，例如：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等；b、可用于蛋白质亚基、膜蛋白、肽类等物质的分析；c、用于大分子物质的折叠结构等方面,变性聚丙烯酰胺凝胶的主要用途：,2)非变性聚丙烯酰胺凝胶（native-PAGE）（迁移率受其碱基组成和序列的影响）,主要用途：高纯度双链DNA片段的分离和纯化 SSCP（单链构象多态性,相同长度的DNA单链其碱基顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同）等 蛋白质的分离与鉴定等,非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性SDS-PAGE电泳在操作上基本相同，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。,Native-PAGE与SDS-PAGE的区别：,Native-PAGE 可以保持蛋白的天然构象与活性。电泳过程中，电压过高会引起发热而导致蛋白质变性。SDS-PAGE 适用于绝大多数蛋白，分离只与分子量有关。Native-PAGE:蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关,根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1.按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边，防止封闭不严而使聚 丙烯酰胺液漏出.2.将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角.3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.4.加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液 体接近溢出时为止.5.立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板 上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使 成10角，可减少液体泄漏的机会.6.室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1XTBE 缓冲液.7.小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合 的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则.8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不 要产生气泡.9.接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳.10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.11.电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻 璃板，让凝胶吸附在另一块玻 璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中，1530min后取出水洗紫外仪下观察结果.12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度，可用银染.,7.3 DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).,聚丙烯酰胺凝胶的特点：1.分辨率极高；长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。2.比琼脂糖凝胶的载样量大；3.回收的DNA样品纯度极高，可用于要求非常严格的实验，如转基因动物实验；4.聚丙烯酰胺凝胶无色透明。比琼脂糖凝胶的紫外线吸收低、抗腐蚀性强、机械强度高、韧性好。,主要用途：聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定：低分子量蛋白质(低于100道尔顿)、小于1Kb的DNA片段 和 DNA序列分析。,DNA染色:,溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间。并在302nm波长的紫外光照射下有最大红色荧光(590nm)发出。,a.溴化乙锭(Ethidium bromide，EB),EB的突出缺点：为中度毒性的强诱变剂,(302nm透照，254nm外照),EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 g/ml。,注意：如果已知DNA片段准确大小，凝胶最好在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色,电泳载样缓冲液(Loading buffer):核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青.指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。,载样缓冲液的作用:增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内;在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置;使样品呈色，加样操作更方便.,溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.,b.银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.,c.荧光染料SYBR Green I,A minor groove binding dye,半定量RT-PCR 或 定量PCR,PFGE 诞生的背景：A、超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。B、大于40kb的极限长度后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。,8.脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE),1984年,和发明的脉冲电场凝胶电泳(PFGE)技术可以成功地分离整条染色体这样的超大分子量的DNA分子。,PFGE 的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子 严格说来，应叫交替电场凝胶电泳,PFGE类型,垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field)场翻转系统(field inversion)旋转胶系统(rotating gel)箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field),垂直或横向交变系统,场翻转系统,箝位匀强电场系统,旋转胶系统,影响分辨率的因素,1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。,3 电场夹角：电场方向的夹角常为1100-1200，研究证实900夹角也非常有效的。4 温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在4 进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。,