《基因工程的基本操作程序》课件6(新人教版必修3).ppt
,课题二、基因工程的基本操作程序,课题二、基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定,(一)、目的基因的获取,获取目的基因是实施基因工程的第一步。,可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。,目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因,获取目的基因的方法：从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库）利用PCR技术扩增目的基因（变性，复性，延伸）通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成,目的基因来源,（三）基因操作的基本步骤,步骤一：目的基因的提取,2）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA(即目的基因),反转录,合成,3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,人工合成基因,合成,蛋白质的氨基酸序列,推测,mRNA,推测,目的基因,结构基因的核苷酸序列,目的基因的,mRNA,反转录,单链DNA,双链DNA,合成,反转录法,人工合成基因,编码区,非编码区,非编码区,原核生物的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,启动子与起始密码终止子与终止密码,起始密码,终止密码,启动子,终止子,真核生物的基因结构,信使RNA,成熟的信使RNA,(二)、基因表达载体的构建,基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。,目的：使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因,启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。,终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。,标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,(三)、将目的基因导入受体细胞,转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,（1）目的基因导入植物细胞,常用：-农杆菌转化法(感染双子叶植 物和裸子植物)基因枪法花粉管通道法,（2）将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,（3）将目的基因导入微生物细胞,常用大肠杆菌：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少,大肠杆菌的转化方法：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。,四、目的基因的检测和表达,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传性状，只有通过检测与鉴定才能知道。这是检查基因工程是否成功的一步。,首先，要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术,其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。检测方法是采用DNA分子杂交技术,最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测方法是进行抗原-抗体杂交,Sourthern杂交-DNA与DNA分子间的杂交(见同步导学12页)将受体生物的DNA提取出来，经过适当的酶切后，走电泳，将大小不同的DNA片段分开，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带，则表明受体生物染色体DNA上有目的基因。,Northern杂交-DNA与RNA分子间的杂交,Western杂交-蛋白质分子间的杂交（抗原-抗体）,个体生物学水平的鉴定：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。,有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。,1）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,提取目的基因,基因表达载体的构建,目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,
