《发酵过程控制》课件.ppt

第7章 发酵工艺控制,微生物学教研室,发酵工艺控制最优化,在特定的发酵生产过程中，生产效率的高低取决于工艺和工艺控制的最优化，即能否实现生产过程内的最优化控制。生产过程最优化控制的实现，包含了从明确目标到目标值实施等全部内容。,如何实施最佳工艺？,实施最佳工艺就是通过优化管理，严格执行发酵工艺，将发酵控制在最佳状态，从而最终实现目标值，达到最大的比产物生成速率。要实现最佳工艺必须对诸如温度、pH、溶解氧浓度、泡沫等进行控制。,明确控制目标,明确影响因素,确定实现目标值的方法,确定最佳工艺,实施最佳工艺,发酵工艺控制最优化,问题,第一节 温度变化及其控制,一、温度对生长的影响,不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于026oC生长，嗜温菌适应于1543oC生长，嗜热菌适应于3765oC生长，嗜高温菌适应于65oC以上生长,每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。,微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。,1、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致。,二、微生物与温度相关性的原理,什么是液晶状态？液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态。由固态转变为液晶态的温度称为熔点，以T1表示；由液晶态转变为液态的温度称为清亮点，以T2表示。T1与T2之间的温度称为液晶温度范围。那么为什么不同微生物对温度的要求不同呢？根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。嗜热菌只含饱和脂肪酸，而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。,2、蛋白质结构,人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的结构完整性和催化功能：(1)通过自然或诱导突变，将特定残基发生改变的蛋白与其天然结构进行对比；(2)对比同属嗜热、嗜温及嗜冷菌的蛋白结构,通过对嗜冷酶的蛋白质模型和X一射线衍射分析表明，嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用,嗜冷菌具有在0oC合成蛋白质的能力。这是由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在OoC合成蛋白质，一方面是由于其核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。,3、蛋白质合成,4、合成冷休克蛋白 低温微生物适应低温的另一机制是合成冷休克蛋白。将大肠杆菌从37oC突然转移到10oC条件时细胞中会诱导合成一组冷休克蛋白，它们对低温的生理适应过程中发挥着重要作用，检测嗜冷酵母的冷休克反应，发现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内大量产生。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，它们必须忍受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白是密切相关的。,二、温度的影响与控制,（一）温度对发酵的影响,1、温度对微生物细胞生长的影响,发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 积分得 E=,E活化能,Kr速率常数,K与温度有关E越大温度变化对K的影响越大,温度对细菌的生长、产物合成的影响可能是不同的,青 霉 素,12oC30oC,2.温度对产物形成的影响,3.温度影响发酵液的物理性质 温度还可以通过改变发酵液的物理性质,间接影响微生物的生物合成。如:温度对氧在发酵液中的溶解度就有很大的影响。,4、温度影响生物合成的方向,四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于30oC时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到35oC时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。,三、发酵过程引起温度变化的因素,（一）发酵热Q发酵,发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。现在来分析发酵热产生和散失的各因素。,1、生物热Q生物,在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。,生物热与发酵类型有关,微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水好氧：产生287.2千焦耳热量，183千焦耳转变为高能化合物 104.2千焦以热的形式释放厌氧：产生22.6千焦耳热量，9.6千焦耳转变为高能化合物 13千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为63.7和42.6,培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。生物热的大小与呼吸作用强弱有关 在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。,2、搅拌热Q搅拌,在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：Q搅拌P8604186.8（焦耳/小时）P搅拌轴功率 4186.8机械能转变为热能的热功当量,电机功率P=,E额定电压I额定电流cos功率因素，1千瓦时8604186.8焦耳,3、蒸发热Q蒸发,通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热Q显热，显热很小，一般可以忽略不计。,4、辐射热Q辐射,发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5。Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射,（二）发酵热的测定,有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵GCm(T出T进)Cm水的比热G冷却水流量,另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。,根据化合物的燃烧值估算发酵过程生物热的近似值。因为热效应决定于系统的初态和终态，而与变化途径无关，反应的热效应可以用燃烧值来计算，特别是有机化合物，燃烧热可以直接测定。反应热效应等于反应物的燃烧热总和减去生成物的燃烧热的总和。,H（H）反应物（H）产物如谷氨酸发酵中主要物质的燃烧热为：葡萄糖 159555.9KJ/Kg谷氨酸 15449.3KJ/Kg玉米浆 12309.2KJ/Kg菌体 20934KJ/Kg尿素 10634.5KJ/Kg,可根据实测发酵过程中物质平衡计算生物热。例如某味精厂50M3发酵罐发酵过程测定结果的主要物质变化如表：,发酵1218小时的生物热为：Q生物24159555.90.612309.2610634.51.22093415.415449.3191098.1KJ/M3191098.1631849.7每小时的生物热为31849.7KJ/M3,四、最适温度的选择,1、根据菌种及生长阶段选择,微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为37oC，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为3032oC，青霉菌生长温度为30oC。,在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以延緩衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段28oC，合成期26oC后期再升温；黑曲霉生长37oC，产糖化酶3234oC。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长3032oC，产酸3437oC。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。,根据生长阶段选择,例：林可霉素发酵的变温培养,问题的提出 接种后10h左右已进入对数生长期，随后是10h左右的加速生长期，在40h左右对数生长期基本完成，在50h左右转入生产期主要问题：如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在,根据生长阶段选择温度,变温培养的正交设计,结论：前60h按31控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础60小时后将罐温降至3O使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素发酵进入后期罐温再回升至31 使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。,2、根据培养条件选择,温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。,3、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。,五、利用温度控制提高产量,例1 利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量,背景：（1）酵母在比常规发酵温度髙10200C的温度下经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。（2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐受力（3）Toshiro发现热冲击可使胞内3磷酸甘油脱氢酶的活力提高1525，并导致甘油产量提高,实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量正交条件A 冲击温度（0C）40，45，50 B 开始时机（h）8，16，30 C 冲击时间（分）15，30，60结果发酵16小时，450C冲击60分钟最佳，发酵96小时后甘油浓度提高32.6，发酵罐实验见图（A）16h,450C,30min（B）12h,450C,30min,A 温度；B 开始时机；C 冲击时间,A比B好,例2 重组大肠杆菌人Cu/Zn-SOD的高表达Lac启动子，用乳糖作诱导剂 270C 300C 340C 370CSOD 4966 14270 6590 4638比活 810 1471 679 526蛋白 6.129 9.70 9.79 11.88OD600 7.41 10.72 11.78 24.77,原因：1、乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合成SOD的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都增加。2、高温下可能SOD降解速率增加，杂蛋白增加3、低温下由于比生长速率低，质粒脱落减少4、低温下菌的衰老减缓，死亡率低,小 结,微生物最适生长温度微生物对温度的要求不同与它们的膜结构有关微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致,微生物对温度的要求与酶分子结构的区别有关，如蛋白构象稳定性因素改变，活性位点关键区域氨基酸的取代，离子束缚作用(ion binding)减弱，蛋白核心区域疏水作用下降等,温度对发酵的影响：温度影响反应速率温度影响发酵方向,最适温度的选择,根据菌种生长阶段选择根据培养条件选择菌种的生长情况,发酵过程引起温度变化的因素发酵热是引起发酵过程温度变化的原因Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射,生物热的定义，产生的原因：基质代谢。它与菌种、发酵类型、生长阶段、营养条件有关,搅拌热与搅拌功率有关,发酵热测定:冷却容量 燃烧热,思考题1。发酵热的定义2。生物热的大小与哪些因素有关？3。温度对发酵有哪些影响？4。发酵过程温度的选择有什么依据？,第二节 pH对发酵的影响及控制,pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。,发酵过程中pH是不断变化的，通过观察pH变化规律可以了解发酵的正常与否,大多数微生物生长都有最适pH范围 细菌：6.37.5 霉菌和酵母：36 放线菌：78 微生物生长最适pH与产物积累最适pH不一定一致 例如：链霉素生长最适pH:6.36.9 形成产物最适pH:6.77.3,黑曲霉pH23时合成柠檬酸，pH值接近中性时积累草酸。谷氨酸生产菌在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下形成谷氨酰胺。谷氨酸发酵在不同阶段对pH值的要求不同，发酵前期控制pH7.5左右，发酵中期pH7.2左右，发酵后期pH7.0，在将近放罐时，pH6.56.8为好。梭状芽孢杆菌丙酮丁醇发酵，pH值在中性时，菌种生长良好，但产物产量很低，实际发酵最适pH值为56。链霉素产生菌生长最适pH值为6.27.0，合成最适pH值为6.87.3。,同种微生物对pH变化的反映不同。如，石油代蜡酵母,pH 3.55.0 生长良好，不易染菌；,pH 5.0时，易染细菌；,pH 3.0时，生长受抑制，易自溶；,例如：生产利福霉素的地中海诺卡菌进行发酵研究，pH为6.0,6.8,7.5三个出发值，结果发现pH为6.8,7.5时，最终发酵液的pH都达到7.5左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平；pH为6.0时，发酵中期的pH只有4.5，菌浓仅为20%，发酵单位为零。这说明菌体仅有一定的自调能力。,不同的菌体有不同的pH自调能力,发酵过程pH值变化的规律性,生长阶段pH有上升或下降的趋势,生产阶段pH趋于稳定，维持在最适合产物合成的范围,菌体自溶阶段pH上升，代谢终止,一、发酵过程pH变化的原因,1、基质代谢,（1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降,生理碱性物质 有机氮源和某些无机氮源的代谢、玉米浆中的乳酸被氧化后可使pH上升，这些物质被称为生理碱性物质。生理酸性物质 碳源的代谢，如糖类不完全氧化时产生的有机酸，脂肪不完全氧化产生的脂肪酸，或者某些铵盐氧化后产生的硫酸等，可使pH下降，这些物质被称为生理酸性物质。,如灰黄霉素发酵的pH值变化，就与所用碳源种类有密切关系，如以乳糖为碳源，乳糖被缓慢利用，丙酮酸堆积很少，pH值维持在67之间；如以葡萄糖为碳源，丙酮酸迅速积累，使pH值下降到3.6，发酵单位很低。,2、产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,3、菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。,引起发酵液pH值变化的常见因素(1)下降培养基中C/N不当，有机酸积累；消沫油加得过多；生理酸性物质过多；(2)上升C/N比例不当，N过多，氨基氮释放；生理碱性物质过多；中间补料时碱性物加入量过大；,发酵液的pH值变化是菌体代谢反应的综合结果。从代谢曲线的pH值变化就可以推测发酵罐中的各种生化反应的进展和pH值变化异常的可能原因。在发酵过程中，要选择好发酵培养基的成分及其配比，并控制好发酵工艺条件，使pH值稳定维持在最佳的范围内。,二、pH对发酵的影响,例 pH对林可霉素发酵的影响,林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。,1、实例,pH,7.0,t,不调pH,调pH,效价,pH,例：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响,pH在47范围内产酶最高,2、pH对发酵的影响,（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻,（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行,（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用,（4）pH影响代谢方向 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH23时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺,(5)pH影响菌体的形态如：产黄青霉细胞壁的厚度和菌丝的长度均随pH的变化而变化。（6）pH影响产物的稳定性,影响产物稳定性：-内酰胺抗生素沙纳霉素的发酵中，pH在6.77.5之间时抗生素的产量相近，高于或低于这个范围，合成受到抑制。在这个pH值范围内，沙纳霉素的稳定性未受到严重影响；但pH7.5时，稳定性下降，半衰期缩短，发酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位低，也与青霉素的稳定性有关。,不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于7.5时，菌体易于老化，呈现球状；当pH值低于6.5时菌体同样受抑制，易于老化。而在7.2左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在6.9左右时，菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势。,pH对L-异亮氨酸发酵菌的影响,3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,pH对菌体生长影响比产物合成影响小例 青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适pH7.27.4 四环素：菌体生长最适pH6.06.8，产物合成最适pH5.86.0,X,pH,四环素,三 发酵过程中pH值的调节及控制1）发酵pH值的确定（范围，时间）一般是在58之间，如谷氨酸发酵的最适pH值为7.58.0。随菌种和产品不同而不同。同一菌种，生长最适pH值可能与产物合成的最适pH值是不一样的。按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH，使产量最大。,2）最佳pH的确定,配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况,pH对产海藻酸裂解酶的影响,pH对海藻糖水解酶产生的影响,pH菌浓 pH酶活,发酵过程的pH控制,pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响,pH对热凝胶生产的影响 热凝胶发酵菌体生长和热凝胶合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两个阶段：前10 h是菌体生长期，之后热凝胶开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。在菌体生长期，DO 直线下降，培养液中的pH也迅速下降。10 h左右，菌体质量浓度达到最大值，DO 和pH降至最低点（5.45.6），菌体生长结束。此后进入热凝胶合成期。,试验两阶段的最适pH，见表,稳定期随着pH降低，糖耗速率增加，生物量增加，但产物合成速率在pH5.6时达到最高。说明当pH小于5.6以后微生物消耗的糖并非用于合成热凝胶，而是合成菌体。,在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适pH值、菌体的比生长速率()和产物比生成速率(Qp)等3个参数的相互关系有四种情况(见图10-1)：和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内(a)，这种发酵过程易于控制；Qp(或)的最适pH值范围窄，而(或Qp)的范围较宽(b)；和Qp对pH值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的(c)，第二、第三种情况的发酵pH值应严格控制；和Qp有各自的最适pH值(d)，应分别严格控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。,微生物生长最适pH和产物最适pH相互关系存在四种情况：,：菌体的比生长速率Qp：产物的比生产速率,在发酵过程中，发酵液的pH随着微生物活动而不断变化，为提供菌体适宜的生长或产物积累的pH值，需要对发酵生产过程各阶段的pH值实施控监控，实际生产中，从以下几个方面进行：（一）调整培养基组分：适当调整C/N比，使盐类与碳源配比平衡，一般情况：C/N高时（真菌培养基），pH降低；C/N低时（一般细菌），经过发酵后，pH上升,在生产上，主要的过程控制方法有：添加CaCO3：当用NH4+盐作为氮源时，可在培养基中加入CaCO3，用于中和NH4+被吸收后剩余的酸.氨水流加法：氨水可以中和发酵中产生的酸，且NH4+可作为氮源，供给菌体营养.通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水(浓度20左右)，采用少量间歇添加或连续自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱。氨极易和铜反应产生毒性物质，对发酵产生影响，故需避免使用铜制的通氨设备。,尿素流加法：味精厂多用，尿素首先被菌体尿酶分解成氨，氨进入发酵液，使pH上升，当NH4+被菌体作为氮源消耗并形成有机酸时，发酵液pH下降，这时随着尿素的补加，氨进入发酵液，又使发酵液pH上升及补充氮源，如此循环，致至发酵液中碳源耗尽，完成发酵。氨基酸发酵常用此法。这种方法既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。也就是说，采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。,3）发酵pH的控制,（1）调节好基础料的pH。关键是生理酸性物质与生理碱性物质的配比，基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.56.8,（2）在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等,在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH(2)当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4,（4）当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,（3）通过补料调节pH,应急措施：改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；改变温度，以控制微生物代谢速度；改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量；改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；,分别在4种缓冲介质中，于pH 6.50一9.50测定天冬酰胺酶酶活力1 甘氨酸介质pH 8.00时酶活力最高；2 硼酸在pH 850，酶反应最快3 磷酸在pH 850，酶反应最快4 Tris在pH 850，酶反应最快酶活1243,（5）不同调pH方法的影响,天冬酰胺酶,不同pH控制方式对目的突变株ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。“1”表示只加CaC03控制pH值，“2”表示只加尿素控制，“3”表示CaC03和尿素联合控制pH值。,异亮氨酸发酵,例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）,菌株最适生长pH控制在6.87.0,（6）发酵的不同阶段采取不同的pH值,pH6.9时，菌体生长旺盛，pH7.15时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9，到48h后pH值为7.15，到80h后pH值为7.25。产率22.27g/L，产酸率提高12.23。,例：克拉维酸发酵中pH变换控制,问题的提出：在pH低时菌体生长受抑制，在高pH时克拉维酸要分解,用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现，前期由于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pH降至6.5。在达到最高细胞浓度后，pH开始从6.5升至8.3。CA产量达最高水平时，pH不再升高。在发酵终止时，pH再次升至8.5。随着pH升高，CA迅速分解。,研究不同pH对发酵的影响分别配置pH为6.0，7.0，8.0的培养基测定菌的生长和产物合成,pH6.0时，生长受抑制，产物降解少,pH8.0时生长良好产量低，产物降解,pH7.0时的状况,控制pH7.0和8.0时，最高细胞浓度接近相同(约16PMV)，但控制pH6.0时细胞生长受抑制。在2.5升生物反应器内，不控制pH时2.47g(mLh)控制pH7.0时的产率3.37g(mLh)最高控制pH8.0时，产率2.02g(mLh)在控制pH6.0时，CA产生被抑制,但降解少因此对细胞生长和CA产生最好将pH控制于7.0，但在控制pH7.0时，仍出现CA的迅速分解。,由于CA生产的最适pH和减少CA分解的pH各不相同，因此在分批发酵中应用了pH变换策略，使发酵pH由中性pH7.0变换为酸性pH6.0。在发酵前期，在细胞生长和产生CA期间控制pH7.0，4d后，当CA产量达最高值时，变换pH为6.0，以减少CA分解。最高CA浓度可保持24h。由于改变pH，使CA分解速率明显降低。,发酵过程的pH控制,pH值调节和控制的方法,pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。在实际生产中，调节和控制发酵液PH值的方法应根据具体情况加以选择。PH值调节和控制的方法主要有：,1、调节培养基的原始pH值，或加缓冲溶液（如磷酸盐）制成缓冲能力强、pH值变化不大的培养基，或使盐类和碳源的配比平衡。,2、可在发酵过程中加入弱酸或弱碱进行pH值的调节，进而合理地控制发酵条件；也可通过调整通风量控制pH值。,3、采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH+4被微生物细胞利用后，剩下的酸根会引起发酵液pH值的下降，在培养液中可加入碳酸钙来调节pH值。但是需要注意的是，碳酸钙的加入量一般都很大，在操作上很容易引起染菌。因此，此方法在发酵过程中应用不是太广。,4、在发酵过程中根据pH值的变化可用加氨水的方法来调节，同时又可把氨水作为氮源供给。由于氨水作用快，对发酵液的pH值波动影响大，应采用少量多次的流加方法进行流加，以免造成pH值过高，从而抑制微生物细胞的生长，或pH值过低，NH+4不足等现象。具体的流加方法应根据微生物的特性、发酵过程的菌体生长情况、耗糖情况等来决定，一般控制在pH值，最好是采用自动控制连续流加方法。,5、如果仅用酸或碱调节pH值不能改善发酵情况时，进行补料是一个较好的办法，它既调节了培养液的pH值，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高发酵产物的产率。通过补料调节pH值来提高发酵产率的方法已在工业发酵过程中取得了明显的效果。,6、以尿素作为氮源进行流加调节pH值，是目前国内味精厂普遍采用的方法。尿素流加引起的PH值变化有一定的规律性，易于控制操作。由于通风、搅拌和微生物细胞内脲酶的作用使尿素分解放出氨，使pH值上升；同时氨和培养基中的营养成分被微生物利用后和补充氮源。当流加尿素后，尿素被微生物的脲酶分解放出氨，使pH值上升，氨被微生物利用和形成代谢产物，使pH值降低，再次反复进行流加就可维持一定的pH值。流加时除主要根据pH值的变化外，还应考虑到微生物细胞的生长、发酵过程耗糖、代谢等不同的阶段采取少量多次流加，以控制合适的发酵pH值。,目前已有适合于发酵过程pH值的测量的电极，连续测量并记录pH值的变化，用于控制和监测发酵pH值。,小 结,发酵过程pH会发生变化,变化原因,基质代谢,产物形成,菌体自溶,对发酵的影响,pH,pH影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离pH影响代谢方向,pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,pH的控制方式,基础培养基调节pH,在基础料中加入维持pH的物质,通过补料调节pH,当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH,发酵的不同阶段采取不同的pH值,选择合适的pH调节剂,思考题1.发酵过程中pH会不会发生变化为什么？2.pH对发酵的影响表现在哪些方面？3.为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实验？4.发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？,发酵过程的pH控制,第三节 氧对发酵的影响,即使培养基被空气饱和，它所贮存的氧量仍然是很少的，在发酵旺盛时期，一般只能维持正常呼吸1530s。,溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。,氧是一种难溶于水的气体,生物氧化中氧吸收的效率多数低于2，通常情况下常常低于1。通入发酵罐约99的无菌空气被白白浪费掉。而且大量无用空气是引起多泡沫的因素。,（一）氧的传递,1、氧传递的各种阻力,氧气从气泡传递至细胞内,需要克服一系列阻力,供氧方面的阻力,耗氧方面的阻力,1/KG-气相主体到气液界面的气膜传递阻力1/KI-气液界面的传递阻力1/KL-从气液界面通过液膜的传递阻力1/KLB-液相主体的传递阻力1/KLC-细胞或细胞团表面的传递阻力1/KIS-固液界面的传递阻力1/KA-细胞团内的传递阻力1/KW-细胞壁的阻力1/KR-反应阻力,OTRKLa（C*CL）OTR单位体积培养液中的氧传递速率mol/(m3s)a比表面积（m2/m3）KL以氧浓度为推动力的总传递系数（m/s）C*与气体主体氧分压平衡的液相氧浓度（mol/m3）CL液相主体氧浓度（mol/m3）,2、氧的传递方程式：,容积传递系数KLa可用于测定发酵罐的通气能力，在实验条件下KLa越大则说明系统的通气能力越强。,稳定状态时,Cc菌体细胞的浓度（g/L）QO2微生物的呼吸强度mol/(kgs),C*CL 推动力,（二）影响微生物对氧需求的因素,微生物的耗氧速度常用单位质量的细胞（干重）在单位时间内消耗氧的量，即比耗氧速率（或呼吸强度）来表示。,CL溶解氧浓度（mol/m3),比耗氧速率（或呼吸强度）mol/(kgs),最大比耗氧速率mol/(kgs),k0氧的米氏常数（mol/m3),摄氧率：单位体积培养液，在单位时间内消耗的氧量。rQO2X r摄氧率mol/(kgs)X细胞浓度（kg/m3),各种微生物的呼吸强度是不同的，并且呼吸强度是随着培养液中溶解氧浓度的增加而加强，直至达到一个临界值为止。这个临界值称为“临界氧浓度”(CCr)临界氧浓度(CCr)：一般指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。,一般对于微生物：CCr:125%饱和浓度,影响摄氧率的因素,细胞浓度直接影响：在分批发酵过程中，在对数生长期的后期达到峰值。,培养基的成分和浓度显著影响摄氧率。,另外，微生物呼吸强度的临界值还与一些培养条件如PH值、温度有关。,有时溶解氧浓度对细胞生长和产物生成的影响可能是不同的，即对于细胞生长的最佳氧浓度，不一定就是形成产物的最佳氧浓度。溶解氧浓度与临界氧浓度之比称为氧的满足度,溶氧对黄色短杆菌生产各种氨基酸的影响,（三）影响供氧的因素,OTRKLa（C*CL）推动力容积传递系数发酵罐高度、发酵液体积及物理性质,调节Kla是最常用的方法，Kla反映了设备的供氧能力。,45升 1吨 10吨搅拌速度 250 rpm 120 120供氧速率 7.6 10.7 20.1,不同的设备供氧能力不一样,氧对发酵的影响,A、影响摇瓶Kla的因素,装液量和摇瓶机,摇瓶机,往复，频率80-120分/次，振幅8cm,旋转，偏心距25、12,转述250rpm,氧对发酵的影响,影响Kla的因素,装液量，一般取1/10左右：250ml 15-25 ml 500ml 30 ml 750ml 80 ml,例：500 ml 摇瓶中生产蛋白酶，考察装液量对酶活的影响 装液量 30 ml 60ml 90ml 120ml 酶活力 713 734 253 92,氧对发酵的影响,B、影响发酵罐中Kla的因素,1 搅拌2 空气流量3 培养液性质4 微生物的生长5 消泡剂6 离子强度,小型发酵罐和大型发酵罐调节Kla的特点,小型发酵罐，转速可调,大型发酵罐，转速往往不可调,大型反应器的合理设计,对现有设备一定要注意工艺配套,1、影响KLa的因素,（1）搅拌搅拌器：可将通入培养液的空气打散成细小的气泡；使液体形成涡流延长气泡在液体中的停留时间；增加液体的湍动程度减少气泡外滞流液膜的厚度；使培养液中的成分均匀分布。,Kl aK（PG/V）awsK常数PG搅拌功率V培养液体积 ws通气的表观线速度、发酵罐体积、搅拌器形状和结构有关,不同形式搅拌器的和值,从搅拌程度来说，以平叶涡轮最为激烈，功率消耗也最大，弯叶次之，箭叶最小。,搅拌功率液不是越大越好，因为过于激烈的搅拌，产生很大的剪切力，可能对细胞造成损伤；产生大量的搅拌热。,一般带搅拌器的发酵罐中，都装有46块挡板，或以蛇管兼做档板。档板能使液体形成轴向运动，因此提高了混合效果。,（2）空气流量,K La值随着空气流量的增加而增加，但并非没有限度。如果超过这一限度，搅拌器就不能有效地将空气泡分散到液体中，而在大量空气泡中空转，发生“过载”现象。,（3）培养液性质的影响,培养液的密度、黏度、表面张力、扩散系数等影响KLa例：液体的黏度增大时，由于滞流液膜厚度增加，传质阻力就增大，同时黏度也影响扩散系数，致使通气效率降低。,（4）微生物生长的影响,发酵液中细胞浓度的增加，K La值逐渐变小。菌丝体的形态不同也明显影响K La值。例如：球状菌悬液的K La值是相同浓度丝状菌悬液的2倍。,消沫剂分布在气液界面，增大传递阻力，使K L下降。,（5）消沫剂的影响,（6）离子强度的影响,电解质溶液中生成的气泡比在水中的要小的多，a较大。在同样条件下，电解质溶液的K La值比水中的大。并且随着电解质浓度的增加，K La值也有较大的增加。,2、影响推动力的因素,OTRKLa（C*CL）提高推动力实际上是增加氧的饱和度C*在水中，氧的溶解度随温度的升高而降低；在溶液中，氧的溶解度随溶质浓度的增加而下降；,提高发酵罐罐压；提高空气中的氧分压。富氧通气用纯氧来增加氧分压的方法，如深冷分离法，吸附分离法，膜分离法。,小 结：,理解氧传递的各种阻力掌握氧的传递方程式：OTRKLa（C*CL）掌握比耗氧速率、摄氧率、临界氧浓度(CCr)等概念熟悉影响供氧的因素、影响发酵罐中Kla的因素、影响推动力的因素,第四节 CO2对发酵的影响及控制二氧化碳微生物的代谢产物合成产物的一种基质反映微生物生长和发酵状况，可通过碳质量平衡来估算菌体生长速率和细胞量。溶解在发酵液中的CO2对氨基酸、抗生素等微生物发酵具有抑制和刺激作用，对许多产物的生产菌亦有影响。,1 CO2对菌体生长的影响CO2对菌体生长的作用：直接影响排出CO2高于4%时，碳水化合物的代谢及微生物的呼吸速率下降。,一、CO2对发酵的影响,举例：发酵液中溶解CO2浓度为1.610-2 molL时，会严重抑制酵母生长。当进气口CO2含量占混合气体体积的80时，酵母活力只达到对照组的80。一般以1 L(Lmin)的空气流量通气发酵，发酵液中溶解CO2只达到抑制水平的10。,CO2对氨基酸、抗生素等微生物发酵具有刺激作用。例如：环状芽孢杆菌等已经发芽的孢子在开始生长的时候，对CO2有特殊需要。CO2是大肠杆菌和链霉菌突变株的生长因子，菌体有时需要含30 CO2的气体才能生长，称为CO2效应。,CO2影响产物形成：阻碍基质分解和A