《动物基因工程》课件.ppt

河南科技大学,1,第十一章 动物基因工程,河南科技大学,2,第一节 基因工程概述,理论上的三大发现DNA为遗传物质：Avery的肺炎双球菌转化实验DNA双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制遗传密码与中心法则,河南科技大学,3,技术上的三大发明1.限制性内切酶和连接酶：DNA的“手术刀”与“缝纫机”2.载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等3.逆转录酶：从mRNA到 DNA，使真核基因制备成为可能,河南科技大学,4,河南科技大学,5,河南科技大学,6,河南科技大学,7,河南科技大学,8,河南科技大学,9,河南科技大学,10,河南科技大学,11,河南科技大学,12,3、基因工程的内容目的基因的获得目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆 基因表达与产物分离,河南科技大学,13,基因操作中的工具酶手术刀限制性核酸内切酶、核酸外切酶缝纫机连接酶复印机DNA聚合酶、逆转录酶,第二节 基因操作中的工具酶,河南科技大学,14,一、限制性内切酶的概述（一）概念 限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到1000种以上，搞清识别序列的有300种以上。,河南科技大学,15,（二）限制性内切酶命名规则 限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌由株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。如 EcoRI来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于B.amyloliquefaciens,河南科技大学,16,H in d II,Haemophilus(属名),Influenzae(种名),d(株系),罗马数字,限制性内切酶命名举例,河南科技大学,17,（三）限制性内切酶分类,河南科技大学,18,河南科技大学,19,（四）II 型限制性内切酶的特性（1）II型限制酶的识别特异性 回文识别序列 II型限制酶的识别序列大多是具有 双重对称结构性结构,或称回文序列(Palindromic Sequence),河南科技大学,20,（2）识别特定的核苷酸序列，其长度一般为48个核苷酸且呈二重对称。（3）具有特定的酶切位点，即限制性内切酶在其识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。,河南科技大学,21,识别序列(位点)双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列被识别的碱基序列通常具有双轴对称性，即回文序列(Palindromic Sequence)。,EcoR I 的识别序列,河南科技大学,22,二、DNA聚合酶,（一）DNA聚合酶(DNA Polymerase)的基本特性 能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生引物从膜版上的解离作用。DNA-OH DNA-(pdN)n nPPi dATP，dTTP，dCTP，dGTP，Mg2,DNA聚合酶,河南科技大学,23,大肠杆菌 DNA 聚合酶,1E.coli DNA 聚合酶 的活性 5-3 DNA 聚合酶活性。5-3 外切核酸酶活性。3-5 外切酶活性。,河南科技大学,24,2E.coli DNA 聚合酶 的用途,利用 E.coli DNA 聚合酶 的 5-3 外切核酸酶活性，可用切口平移法（nick translation）标记 DNA，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应。用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性。但由于具有 5-3 外切活性，现在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反转录酶（详见后面）。对 3 突出端的 DNA 作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用 T4 或 T7 DNA 聚合酶效果会更好。,河南科技大学,25,（二）Klenow DNA 聚合酶,无53外切活性有聚合活性有 3 5外切活性由于没有 5-3外切活性，使用范围进一步扩大,河南科技大学,26,Klenow DNA 聚合酶用途,补平 3 凹端 DNA。抹平 DNA 3凸端。通过置换反应对 DNA 进行末端标记。在 cDNA 克隆中合成第二链。随机引物标记。应用于 Sanger 双脱氧链末端终止法的 DNA 测序。应用于 PCR 反应，现在已经被 Taq DNA 聚合酶等取代。在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 DNA。,河南科技大学,27,（三）T4 噬菌体 DNA 聚合酶,T4 噬菌体 DNA 聚合酶来源于 T4 噬菌体感染的 E.coli，分子量114kDa。T4 噬菌体 DNA 聚合酶与 Klenow 酶相似，但 3-5 外切活性强 200 倍，且不从单链 DNA 模板上替换引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高 1 倍。,河南科技大学,28,（五）逆转录酶,逆转录酶是一种有效地转录RNA产生cDNA的酶。产物DNA称cDNA，即互补DNA(complementary DNA)，该酶又称为依赖于RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)。逆转录酶在基因工程中的主要用途是以真核mRNA为模板，合成cDNA，用以组建cDNA文库，进而分离为特定蛋白质编码的基因。,河南科技大学,29,（六）末端转移酶,来源于小牛胸腺 催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3 羟基端 dNTP 为 T 或 C，二价阳离子首选 CO 2+；为 A 或 G 首选 Mg 2+对 3 羟基突出末端的底物作用效率最高 在 cDNA 或载体 3 末端加同聚尾用于克隆 用标记的 rNTP、dNTP 或 ddNTP 来标记 DNA 片段的 3 末端。,河南科技大学,30,DNA聚合酶在基因工程中的用途：1)DNA分子的体外合成2)体外突变3)DNA片段探针的标记4)DNA的序列分析5)DNA分子的修复6)聚合酶链式反应(PCR)等,河南科技大学,31,三、DNA连接酶与DNA分子的体外连接,体外DNA片段的连接方式：（1）用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段（2）用T4DNA连接酶将平端的DNA片段连接起来（3）先在DNA片段的末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。注意：1、DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化单链的DNA分子，被连接的 DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶称为连接酶。它催化DNA 5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。,河南科技大学,32,具有3-OH和5-P基团的缺口被DNA连接酶封闭起来,如果缺失一个或数个核苷酸的裂口 DNA连接酶则不能将它封闭起来,注意：2、连接酶如果缺失一个或数个核苷酸的裂口 DNA连接酶则不能将它封闭起来,河南科技大学,33,四、其他酶类,1、T4多核苷酸酶,T4 多核苷酸酶催化ATP的-磷酸基转移至DNA或RNA片段的5-未端。在基因工程中主要用于：1)标记DNA片段的5-端，制备杂交探针，2)基因化学合成中，寡核苷酸片段5-磷酸化，3)用于测序引物的5-磷酸标记。,河南科技大学,34,2、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶的功能是去除DNA或RNA 5-未端的磷酸基，反应可表示为：碱性磷酸酶5p DNA或5p RNA 5HO DNA或5OH RNA碱性磷酸酶可用于：1)去除DNA片段5磷酸，以防止在重组中的自身环化，以提高重组效率。2)在用r-32PATP标记DNA或RNA的5-磷酸前，去除DNA或RNA片段的非标记5-磷酸。,河南科技大学,35,利用碱性磷酸酶CIP防止,载体的再环化,pUC19,SacIKpnISmaIBamHIXbaISalIPslISphIHind III,对接DNA,可通过凝胶电泳纯化靶DNA,3OH,3OH,5”P,5”P,5”P,5”P,3OH,3OH,用T4噬菌体DNA连接酶连接去磷酸化的质粒与靶DNA,3OH,3OH,3OH,3OH,用CIP去除5P,限制性内切酶,3OH,3OH,3OH,3OH,鉴定重组子：检查a互补能力的丧失情况核酸杂交对小量制备的质粒DNA进行酶切分析,CIP：牛小肠提取BAP:大肠杆菌提取,河南科技大学,36,3、核酸酶（nuclease）,核酸外切酶：可降解dsDNA中或DNA-RNA中的一条链核酸内切酶：可切割DNA链中的单链（1）BAL31 核酸酶（BAL31 nuclease）：来源于交替单胞菌，主要活性为 3 外切核酸酶活性，可从线性 DNA 两条链的 3 端迅速去除单核苷酸，随后可从单链 DNA 内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短了的平端双链 DNA 分子（约占 10-20%）以及带有约 5 个核苷酸突出单链的截短分子（约占 80-90%）。对于所形成的单链突出，可用 DNA 聚合酶补平。,河南科技大学,37,（2）Sl 核酸酶（S1 nuclease）,Sl 核酸酶来源于米曲霉，可降解单链 DNA 或 RNA，是一种单链核酸酶。产生带 5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链，对 dsDNA、dsRNA 和 DNA:RNA 杂交体不敏感。酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。该酶可用于分析 DNA:RNA 杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链 cDNA 合成中产生的发荚环。,河南科技大学,38,（3）脱氧核糖核酸酶（DNase）,DNase 来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA。在 Mg 2+存在下，独立作用于每条 DNA 链，且切割位点随机。在 Mn 2+存在下，它可在两条链的大致同一位置切割 dsDNA，产生平端或 1-2 个核苷酸突出的 DNA 片段。,河南科技大学,39,（4）核糖核酸酶 A（Ribonuclease A 或 RNase A）,核糖核酸酶 A 来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3 端。可除去 DNA:RNA 中未杂交的 RNA 区，可用来确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置。广泛用来去除 DNA 样品中的 RNA。核糖核酸酶 A 商品制剂可能会污染其它酶（如 DNA 酶），使用前应加热使 DNA 酶失活。,河南科技大学,40,第三节 基因工程的载体,将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体。,一、基因工程载体的概念：,河南科技大学,41,二、基因工程载体的分类：基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。目前已构建应用的基因工程载体主要有质粒载体噬菌体载体病毒载体人工构建的组合载体,河南科技大学,42,一、细菌质粒载体,质粒介绍：质粒(plasmid)是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从1 kb到300 kb。质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。质粒DNA的特点为：（1）双链环状；（2）分子量很小；（3）自主或半自主复制；（4）不同生物质粒中的基因种类不同。,河南科技大学,43,从分子量大小看,质粒DNA只占细胞染色体组的一小部分，一般约为1-3%，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。质粒赋予寄主细菌一些额外的特性，包括抗性特征，代谢特征，修饰寄主生活方式等。由质粒DNA编码的基因还包括有产生抗菌素的基因、芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因等等。,河南科技大学,44,1质粒的复制 每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。质粒的复制和遗传独立于染色体，但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白质和酶。通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。,河南科技大学,45,质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。松驰型质粒:复制不需要质粒编码的功能蛋白，其复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶(如DNA聚合酶、，依赖于DNA和RNA聚合酶等)来进行。严紧型质粒:复制要求同时表达一个由质粒编码的蛋白质。,2质粒的拷贝数,河南科技大学,46,河南科技大学,47,3质粒的不相容性,两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现 30 多个不相容群，如 ColE1 和 pMB1，pSC101 和 p15A。,河南科技大学,48,4转移性,质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob，转移基因 tra，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。可分为：转移带动转移,河南科技大学,49,5、选择标记,选择标记用于鉴别目标 DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。,河南科技大学,50,氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。,（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr）,河南科技大学,51,（2）四环素抗性基因（tetr）,四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。,河南科技大学,52,（3）氯霉素抗性基因（Cm r,cat）,氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性 P1 噬菌体（也携带 Tn9）。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。,河南科技大学,53,（4）卡那霉素和新霉素抗性基因（kan r,neor）,卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3）-,25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。,河南科技大学,54,二、质粒载体的种类,（一）克隆载体 克隆载体主要用于扩增或保存 DNA 片段，是最简单的载体。,克隆载体必须具备的基本条件：具有复制起点具有抗菌素抗性基因具有若干个限制酶单一识别位点具有较小的分子量和较高的拷贝数,河南科技大学,55,（1)质粒载体 pBR 322 pBR 322大小为4361 bp，由人工改造而来，有一个复制起点、一个抗氨苄青霉素基因、一个抗四环素基因、多种限制酶切点（36个），可容纳5kb左右外源DNA。优点:具有较小的分子量。易于自身DNA的纯化及克隆载体的纯化具有两种抗菌素抗性基因可作转化子的选择记号具有较高的拷贝数。且经氯霉素扩增后，每个细胞中可累计10003000个拷贝。,河南科技大学,56,The bacterial chromosome and bacterial plasmids,as shown in the electron microscope.,河南科技大学,57,Broken cell,The use of plasmid pBR322 as a cloning vector,showing how insertion of foreign DNA causes inactivation of the tetracycline resistance gene,permitting easy identification of transformants containing the cloned DNA fragment,河南科技大学,58,外源基因克隆入质粒载体的过程,河南科技大学,59,DNA cloning using bacterial plasmids,河南科技大学,60,（2）质粒载体pUC 18/19 这对载体由2686bp组成，带有pBR 322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调节片段，一个调节lacZ基因表达的阻遏蛋白(repressor)的基因lac I，还有多个单克隆位点。由于pUC质粒含有Ampr抗性基因和lac Z 基因，可以通过颜色反应和Ampr对转化体进行双重筛选。,河南科技大学,61,多克隆位点,质粒载体pUC 19,MSC 区段,pUC优点：具有更小的分子量，更高的拷贝数；适用于用组织化学方法检测重组子；具有多克隆位点MSC区段，与M13mp8噬菌体相同的克隆区段,河南科技大学,62,（二）其他质粒载体,1、低拷贝数载体2、检测转录控制信号的载体3、表达载体：是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件,河南科技大学,63,噬菌体 噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的DNA，最常见的是双链线形DNA,且感染率高。0.02-0.3 m,二、噬菌体(Bacterophage)载体,河南科技大学,64,噬菌体的形态,河南科技大学,65,噬菌体275,000,Scanning electron microscopy,河南科技大学,66,噬菌体特性：含有线性双链DNA分子，其长度为48502 bp，两端各有12个核苷酸组成的5端凸出的互补粘性末端(cohesive end,cos)，当DNA进入宿主细胞后，互补粘性末端连接成为环状DNA分子。连接处称之为cos位点。噬菌体为温和噬菌体，DNA可以整合到宿主细胞染色体DNA上，以溶源状态存在，随染色体的复制而复制,河南科技大学,67,噬菌体能包装DNA长度的75%-105%的外源DNA，约3854 kb，即使不对DNA进行改造，也允许承载5 kb大小的外源DNA片段带入受体细胞。DNA上的D基因和E基因对噬菌体的包装起决定性作用，缺任何一种基因都将导致噬菌体不能包装。在宿主(受体)细胞中积累大量供包装用的其它壳蛋白。DNA分子上有多种限制性内切酶的识别序列，便于用这些酶切割产生外源DNA片段的插入和置换。但是有的酶在DNA上有多个识别序列，有的识别序列位于必需基因区域，将影响外源DNA片段的插入和置换。,河南科技大学,68,噬菌体的cos末端,河南科技大学,69,构建噬菌体载体的基本途径为：抹去某种限制性内切酶在DNA分子上的一些识别序列，只在非必需区保留1-2个识别序列。若保留1个识别序列，可供外源DNA插入，若保留2个识别序列，则两个识别序列之间的区域可被外源DNA片段置换。用合适的限制性内切酶切去部分非必需区，但是由此构建的DNA载体不应小于38 kb。在DNA分子合适区域插入可供选择的标记基因。,河南科技大学,70,噬菌体载体的主要类型插入型载体：外源DNA克隆到插入型载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力.免疫功能失活（inactivation of immunity function)大肠杆菌半乳糖苷酶失活（inactivation of E.coli-galactosidase)替换型载体 载体DNA分子中有一段可以被替换的DNA片断,河南科技大学,71,用噬菌体作为克隆载体,河南科技大学,72,噬菌体DNA的复制（1)感染早期，环形DNA分子可以按形式从双向进行复制；感染晚期，滚动复制。（2)稳定整合到染色体DNA上复制。噬菌体载体可以成功的应用来作为扩增外源基因拷贝数的克隆载体，使外源基因得到最大限度的表达。已经应用噬菌体载体实现基因克隆和表达的有DNA连接酶、DNA聚合酶I和聚合酶III 亚基等。,河南科技大学,73,基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种。为此，须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的此类基因。这样的基因通常称之为目的基因。目的基因主要是结构基因。目的基因：纯度很高 片断大小适于重组操作,第四节 获得真核生物目的基因的方法,河南科技大学,74,目的基因的获得方法 分离 化学合成,河南科技大学,75,一、利用PCR法获取目的基因,PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链式反应，是80年代发展起来的新技术，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。,摘要：,其过程与 DNA 复制一样有三个步骤：模板变 性，引物与模板复性，延伸。,河南科技大学,76,2、PCR 扩增，主要的是引物设计，引物设计需要遵循一定的原则。3、用于 PCR 的 DNA 聚合酶种类很多，性质各异，可以满足不同的实验需要。4、PCR 技术应用广泛，可以通过 A/T 克隆、UDG 克隆等方法介导克隆，还可以通过同源重组、重叠延伸等方法介导定点诱变。反向 PCR，反转录 PCR 在基因操作中也扮演了重要角色。PCR 技术还广泛应用于鉴定、诊断等领域。,河南科技大学,77,（一）PCR 的基本原理,1基本要素和扩增原理基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。待拷贝的 DNA 称为模板，它可以是双链 DNA 也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。引物是 DNA 复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导 DNA 的合成。在 PCR 扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA 聚合酶是 DNA 复制的动力，在 dNTP 等底物存在时在引物的引导下沿着模板 DNA 合成互补的 DNA 链。,河南科技大学,78,2PCR 扩增的步骤,首先将模板 DNA 置于 92-96，进行变性（denaturation）处理，使 dsDNA 在高温下解链成为 ssDNA，且热变性不改变其化学性质；然后退火（annealing），将温度降至 37-72，使引物与模板的互补区相结合；最后，在 72 条件下，DNA 聚合酶将 dNTP 连续加到引物的 3-OH 端，合成 DNA，这个步骤称为延伸（extension）。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过 20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段。,河南科技大学,79,河南科技大学,80,PCR,河南科技大学,81,PCR：变性退火延伸,河南科技大学,82,（二）PCR 反应体系,1缓冲液 标准的缓冲液含 10mM TrisHCl，pH 为（室温），而在延伸温度（72）下，pH 值接近 7.2。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+，有时使用 Mn2+。一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。,河南科技大学,83,2脱氧核苷三磷酸（dNTP）脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。,河南科技大学,84,3引物 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM，即 1pmol/ml，在 100 l 反应体系中相当于6x1013个分子。如果 5%用于扩增 1kb 的 DNA 片段，可得到 3.3 g 的产物，足以用于常规分析。,河南科技大学,85,4模板模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增，104至107个模板分子可达到满意的效果。用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行扩增时，一般使用 1g DNA,相当于单拷贝基因有 3105 个拷贝。以酵母菌、细菌、质粒和 M13 噬菌体噬菌斑的 DNA 作模板时，要达到这么多拷贝数分别需要 10ng，1ng，1pg 和 1%噬菌斑。,河南科技大学,86,5DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶 来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermus aquaticus），Taq DNA 聚合酶分子量大小为 94kDa，为单分子酶，在 75 活性最强。具有 5-3 合成活性和 5-3 外切活性,但是无 3-5 外切活性。在 95 的半衰期为 40 分钟。启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，在 72 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。由于没有 3-5 外切活性，在扩增过程中有 8.9-11x10-5 的错配几率。,河南科技大学,87,商用混合酶 为了提高扩增的保真度或扩增较长的 DNA 片段，将 Taq DNA 聚合酶的强启动能力和具有 3-5 外切活性的高温 DNA 聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果。,河南科技大学,88,（三）PCR反应程序,1常规程序预变性:94-96 几十秒至几分钟变性：94、30 秒钟退火：50-65、30 秒钟；2535 次循环延伸：72、1 分钟72 保持 3-7min4 保存,河南科技大学,89,2复性（退火）和延伸温度,复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为 72。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR。,河南科技大学,90,3反应时间,变性步骤一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有 30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。,河南科技大学,91,4循环次数,循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为 104105 数量级时，循环数通常为 2535 次。平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。,河南科技大学,92,5PCR 反应液的配制,PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入 DNA 聚合酶。早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。对于使用具 3-5 外切活性的高温 DNA 聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A 管含模板、引物和 dNTP，以及调整体积的 H2O，B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。,河南科技大学,93,按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决这一问题。将 dNTP、缓冲液，Mg2+和 primer 先配制好，然后加入一粒蜡珠（如 Ampli Wax PCR Qam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分。只有当 PCR 反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。,河南科技大学,94,（四）PCR反应体系各成分的主要作用,1、模板DNA：研究对象2、Mg 2+:影响反应的产率和特异性3、反应缓冲液：维持反应环境4、dNTPs：原料，多，速度过快且易出错；少，慢单精度可上升5、TagDNA聚合酶：聚合作用，无纠错功能6、引物：引导起始合成,河南科技大学,95,（五）循环条件的设定,1、变性2、退火3、延伸4、循环次数,河南科技大学,96,（六）引物设计原则,通用原则：1、引物长度：1530Nt为宜2、引物碱基尽可能随机分布3、引物内部不应自身形成二级结构4、两个引物之间不能形成互补结构5、引物3末端与模板配对,河南科技大学,97,加酶切位点PCR引物设计,长度：互补序列大于20，没有上限。3端绝对不能互补；两引物具有较好的协调性；内部二级结构较少；加酶切位点是需要注意保护碱基长度；检测特异性；,河南科技大学,98,（七）PCR技术的应用,1、基因克隆2、不对称PCR与DNA序列测定3、RT-PCR与RNA分析4、基因的体外诱变与突变的检测5、基因组研究,河南科技大学,99,RT-PCR,河南科技大学,100,基因文库(Gene library)包括cDNA文库(cDNA library)和基因组文库(Genomic library)。cDNA是指以mRNA为模板,经反转录酶催化合成DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补DNA或cDNA。,二、基因组文库的构建与基因克隆,河南科技大学,101,基因组DNA文库 从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。,河南科技大学,102,cDNA文库：提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库和基因文库的不同之处在于，cDNA文库除去了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，便于DNA重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。实际为不包含内含子的基因组文库。,河南科技大学,103,DNA片断的部分酶解和全部酶解,一个完整的基因文库应该包括目的生物体所有的基因组DNA。,河南科技大学,104,第五节.目的基因的获得,Making a genomicDNA libraries with plasmid vectors,河南科技大学,105,3种通用的鉴定方法：用标记的DNA探针做DNA杂交用抗体对蛋白质进行免疫杂交对蛋白质的活性进行鉴定,鉴定文库中带有目的序列的克隆的方法,河南科技大学,106,用标记的DNA探针做DNA杂交,通过免疫反应进行基因文库的 筛选,河南科技大学,107,组建一个cDNA文库的步骤：1)分离表达目的基因的组织或细胞2)从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA3）第一条cDNA链的合成，第一条互补DNA链的合成需要RNA模板，cDNA合成引物，逆转录酶，4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+)等。4)第二条cDNA链的合成5)cDNA的甲基化和接头的加入6)双链cDNA与载体的连接,河南科技大学,108,互补DNA的合成原理,mRNA分子的3末端都有poly(A)尾巴,可以与结合寡聚核苷酸oligo(dT)的惰性物质结合,并得以分离,12-20个寡聚核苷酸的oligo(dT)作为引物，合成第一个cDNA链,随机引物法,切割常损失需要的cDNA,形成发卡环的机理不清楚,第一条cDNA,第二条cDNA,河南科技大学,109,基因组DNA文库及cDNA文库的建立,河南科技大学,110,根据研究目的，选择克隆策略,控制基因表达的调控序列mRNA中不存在的特定序列,蛋白质的氨基酸序列,河南科技大学,111,碱基对,玉米,人,果蝇,酵母,物 种,大肠杆菌,5109bp,3.5109bp,1.6108bp,1.4107bp,4106bp,河南科技大学,112,1967年Khorana提出化学合成基因的想法，并进行了实践。1979年Khorana在“Science”上发表了“一个基因的合成”的著名论文。,三、基因的人工合成 DNA 的化学合成,河南科技大学,113,DNA 的化学合成 单链DNA短片段的合成已成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术。化学合成DNA分子是把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5端，而在细胞中DNA分子合成的方向恰恰相反。整个DNA的化学合成过程可以在一个反应柱上连续进行，并且可以对合成过程进行计算机控制。目前常用的化学合成DNA的方法是磷酰胺法。,合成的DNA片段可用于连接成一个长的完整基因，用于扩增目的基因(PCR)、引入突变、作为测序引物，还可用于杂交。,河南科技大学,114,目的基因能否有效地导入受体细胞，取决于是否选用合适的克隆载体,合适的受体细胞和合适的基因转移方法。基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲，是能摄取外源DNA(基因)并使其稳定维持的细胞，从实验目的上讲，是有理论研究价值和应用价值的细胞。基因工程发展到今天，从原核到真核细胞，从简单的真核如酵母菌到高等的动植物细胞都能做为基因工程的受体细胞，受体细胞也不同,所用的基因载体也不同。,第五节 DNA体外重组与基因转移,河南科技大学,115,一、载体与目的基因的连接*DNA 体外重组所需的材料：载体、目的基因、限制性内切酶和连接酶。*原核生物的载体有：质粒，噬菌体等。*真核生物的载体有：动物病毒（一）粘性末端连接法 1、相同限制酶切位点连接 同一限制性内切酶切割不同的DNA，具有相同粘性末端。适合于 DNA片段与DNA片段、载体与DNA 片段的连接。2、不同限制酶切位点连接 两种不同的限制性内切酶切割不同的DNA片段，具有相同类型的粘性末端。,河南科技大学,116,（二）平头末端连接 1、粘性末端转化为平头末端 末端添补法和末端消除法，Kienow片段常用于末端补平，S1和Bal31等核酸酶常用于末端消除。2、连接效率低，一般只有粘性末端的1%。3、提高效率的办法：增加目的DNA片段和连接酶的浓度；（三）人工接头连接 人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列，将其接在目的基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点。（四）同聚物加尾连接 利用末端转移酶在DNA 片段的3末端添加同聚物造成延伸部分。,河南科技大学,117,二、基因的转移 重组体DNA分子导入受体细胞,原核细胞、低等真核生物宿主,高等动、植物细胞宿主,河南科技大学,118,根据所用的载体体系及各种受体细胞的基因型进行选择，要使重组体的转化或转染效率高，能稳定传代，受体细胞基因型与载体所含的选择标记匹配，易于筛选重组体以及外源基因可在其内高效表达和稳定积累等。,补充内容：受体细胞选择的一般原则,原核生物,动物细胞,河南科技大学,119,目前已使用的受体细胞有三大类：（1）微生物表达系统最早使用和至今最广泛使用的是大肠杆菌，其次是酵母和枯草杆菌。（2）植物细胞表达系统因在植物细胞使用的载体很有限，目前主要是农杆菌介导，双子叶植物表达系统使用较多。（3）动物细胞表达系统哺乳动物细胞主要是胚胎细胞和培养的体细胞，但培养条件苛刻，成本较高，且易污染。昆虫细胞既能表达原核基因，又可表达哺乳动物基因，且有较强的分泌能力和修饰能力。,河南科技大学,120,选用克隆载体时注意：1)