《分子克隆》课件.ppt

基因工程 Genetic Engineering,李黄金Email:生命科学与生物制药学院9,基因工程课程内容,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程概论,分子克隆单元操作,大肠杆菌基因工程,非肠道细菌基因工程,真菌基因工程,昆虫基因工程,高等动物基因工程,高等植物基因工程,蛋白质工程、途径工程,第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,用于基因克隆的载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,基因操作常用技术,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,2.6,2.1 用于基因克隆的载体,质粒载体,噬菌体或病毒载体,考斯质粒与噬菌粒,人工染色体载体,载体的基本概念,重要的噬菌粒载体：pUC118/119,pUC118 pUC18+M13间隔区 IG,pUC119 pUC19+M13间隔区 IG,500 个拷贝,3200 bp,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-MG,pUC118/119,表示M13辅助噬菌体DNA,滚环复制,重要的噬菌粒载体：pBluescript（体外转录载体）,pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT7,2958 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,噬菌体启动子PT3和PT7强化外,源基因的转录,提取出来的单链DNA重组分子,在噬菌体RNA聚合酶的存,在下，又可实现外源基因,的体外转录,四、人工染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百,甚至上千 kb 的DNA片段，此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载,量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳,定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外,源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成人工染色体，,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,目前常用的人造染色体载体包括：,细菌人工染色体（BAC）,酵母人工染色体（YAC）,酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes,YAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列：TEL,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制顺序：ARS,酵母染色体的中心粒序列：CEN,酵母系统选择标记：URA3/TRP1,大肠杆菌的复制子:ori,大肠杆菌的选择标记:Ap,YAC载体的装载量为350-400 kb,酵母人工染色体的使用：,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐,细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）,细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的，其装载量范围在50-300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于：,克隆大型基因簇（gene cluster）结构,构建动植物基因文库,细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,优点：能携带大片段DNA，约300kb保留了与F 因子的自主复制、拷贝数控制以及质粒分配等基本功能相关的基因,2.1 用于基因克隆的载体,质粒载体,噬菌体或病毒载体,考斯质粒,人工染色体载体,几类载体的比较,噬菌粒,复制顺序：种类及其对应宿主选择标记：种类及其对应宿主容量（载量）：用途：,第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,克隆载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,基因操作常用技术,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,2.6,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,2.2 DNA的体外重组（切、接）,三、其他用于DNA重组的工具酶,二、T4 DNA链接酶,一、限制性核酸内切酶,四、DNA体外重组操作,1、限制性核酸内切酶的功能与类型,细菌的限制与修饰作用：K/K株；B/株,hsd R：编码限制性核酸内切酶,hsd M：编码限制性甲基化酶,hsd S：负责限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出,2种限切酶：Hind II和Hind III,限制外来DNA（酶切），修饰自身DNA（甲基化保护）,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease),限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,功能,限切/修饰,限切,蛋白结构,异源三聚体,单体,异源二聚体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内,距识别序列下游,24-26bp处,用于DNA重组,限切/修饰,2、II型限制性核酸内切酶,识别序列为4-6碱基对的回文对称结构,是DNA重组中最常用工具酶,识别、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶。,单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性,II 型“限切酶”的识别与切割序列,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列：G/AATTC,EcoR I的切割位点,II型“限制性核酸内切酶”的命名,属名 种名 株名,H i n d II H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中不同限制性核酸内切酶的分离顺序,II型限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 质粒,EcoRI EcoRV,Eschericha coli R 大肠杆菌R质粒,大肠杆菌第一个被分离到的限制性核酸内切酶,3、限制性内切酶识别序列的甲基化修饰,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位,引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、,Bgl II、Sau3A I不受影响,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列,中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,许多类内切酶都有相应的甲基化酶的伙伴，甲基化修饰抑制限切酶活性,5粘性末端3粘性末端平端,4、II 型“限切酶”的切割产物,53,35,53,53,35,35,3-OH,5-P,5-P,3-OH,EcoRI等产生的5粘性末端：,EcoRI 37,退火 4-7,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37,同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶 HindIII HsuI:A/AGCTT同尾酶：识别位点不同，但切出的片段具有相同 的末端序列 BglII：A/GATCT BamHI:G/GATCC 同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。,5、同裂酶与同尾酶,6、“限切酶”酶活性定义,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0-150 mM,DTT,1 mM,Volume,20-100 ml,T T,37 1-1.5 hr,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg 标准DNA所需的酶量。,商品酶提供专用缓冲液,7、限切酶的“星活性”（Star activity）,指在高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等不适当条件下，限制性核酸内切酶识别和切割反应特异性下降的现象。,例：EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者,5AATT3 BamH I,2.2 DNA的体外重组（切、接）,三、其他用于DNA重组的工具酶,二、T4DNA链接酶,一、限制性核酸内切酶,四、DNA体外重组操作,二、T4 DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,A.修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,如：粘性末端退火后,B.修复RNA-DNA杂合分子中DNA链上缺口处 的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,DNA连接酶的基本性质,C.连接多个平头双链DNA分子：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,DNA连接酶的活性单位定义,Tris-HCl,50-100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5-1 mM(不能大于1 mM),DTT,Volume,10-20 ml,T T,4-15 4-16 hr(37 酶活性最高）,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量。,2.2 DNA的体外重组（切、接）,三、其他用于DNA重组的工具酶,二、T4DNA链接酶,一、限制性核酸内切酶,四、DNA体外重组操作,1.DNA聚合酶,1）大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性（未配对的碱基）,大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质：,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dN（dNTP)Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,53的核酸外切酶活性,待切除的核酸分子必须具有5端磷酸基团核苷酸在被切除之前必须是已经配对的被切除的核苷酸可以是脱氧的也可以是非脱氧的,缺口前移标记法,大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途：,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Nick translation,制备32P标记的探针,DNase I,DNA pol I,采用-32P-dATP,缺口前移标记原理,2）大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶：,大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端,三分之二的大肽段，即为Klenow酶,Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核,核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶的基本用途：,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定DNA序列,Klenow酶的基本用途之一：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,Klenow酶的基本用途之二：DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,3）T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性：,在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切,在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性(极强),T4-DNA聚合酶用途之一：,切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-C-C-T-C 5,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多,35的核酸外切酶活性,DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+5 ppp dN 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OH,HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,T4-DNA pol,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA聚合酶用途之二：,35的核酸外切酶活性,4）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本用途之一：以RNA为模板合成cDNA链,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,反转录酶,Mg2+dNTP,5TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,反转录酶的基本用途之二：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,反转录酶,3 RNA,5 DNA,3,5,3 RNA,5 DNA,3,5,反转录酶,5 DNA,3,2、核酸酶,1）单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+(唯一),ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,能够从5末端或3末端降解DNA分子,底物是单链的DNA分子,2）双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）,ExoIII,3,5,3,5,Mg2+,3,5,3,5,大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从双链的3 端外切而产生单链区,配合使用Klenow酶,便可进行放射性标记,3）双链核酸外切酶：l 核酸外切酶（lExo）,lExo,3,5,3,5,Mg2+,l核酸外切酶特异性地从5 端外切,3,5,3,5,A、将双链DNA变成单链DNAB、从双链DNA中移去5突出末端,4）单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae）,Zn2+必需,最适pH范围为4.0-4.3,需要NaCl 10-300 mM,降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5 dNMPs 或 5 NMPs,S1核酸酶的基本用途：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5,nick,gap,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1 mapping）,DNA,mRNA,杂交,S1,EcoRI,5）单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）,Ca2+,5 dNMPs 或 5 NMPs,ssDNA or RNA,Ca2+,Ca2+,单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA缺失突变,EcoRI,A,B,C,EcoRI,EcoRI,B,C,A,Bal31,B,C,A,环化,A,C,3、核酸修饰酶,1）末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）,TdT的基本特性：来自小牛胸腺,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,TdT的基本特性：,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+dATP,5 p,3 HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH 3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,AAAAAAAAAAA,2）碱性磷酸单酯酶,来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）50,来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）,5 p,OH 3,DNA or RNA,5 ppp dN,5 pppN,BAP/CIP,OH 3,5 HO,5 HO dN,5 HO N,可以有效防止载体自身环化,3）T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5-OH上加磷,5 HO,3 HO,OH 3,OH 5,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,5 p,3 HO,OH 3,p 5,用于探针的末端同位素标记：,2.2 DNA的体外重组（切、接）,三、其他用于DNA重组的工具酶,二、T4DNA链接酶,一、限制性核酸内切酶,四、DNA体外重组操作,四、DNA体外重组操作,提高重组率的策略,DNA酶切片段的连接策略,DNA的酶切操作策略,1、DNA酶切组合策略与操作,尽量采用双酶切片段重组（基因插入方向确定）,尽量不要采用多克隆位点中紧邻的酶,不能采用外源基因内部有切点的酶,尽量采用同盐浓度要求的酶组合,尽量采用常用酶组合,尽量通过PCR引物设计优 化酶切组合,1）限切酶的盐浓度要求与操作,低盐酶：0-50 mM,中盐酶：100 mM,高盐酶：150 mM,限切酶活性对盐浓度高度敏感，据盐浓度要求分三类：,多酶联合酶解时的策略,A、对盐浓度要求相同的酶可以同时酶切,5 GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,BamHI SmaI,5 GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT3,3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5,但应注意：紧密相连时难切割,B、对盐浓度要求不同的酶，可采取下列策略：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,2）DNA样品纯度要求与操作,待酶切DNA样品必须达到较高纯度，样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等杂质过多抑制酶活性。策略：,加大酶的用量,加大反应总体积,延长反应时间,3）DNA局部酶切消化,在基因文库构建中具有重要意义DNA分子中只有部分限制位点被内切酶所切割而产生不完全消化的产物可以通过缩短酶切消化反应的时间，降低反应的温度，减少酶用量来达到局部消化的目的.,2、DNA连接策略与操作,一粘一平末端的连接（简单）,单酶切粘性末端的连接,双酶切粘性末端的连接（简单）,平端的连接,不匹配末端的连接,1）单酶切粘性末端的连接：载体5端用碱性磷酸酯酶去磷 酸化防自环,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,外源片段有2个插入方向,外源片段,载体,2）同尾酶生产的粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,5,5,BglII,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,外源片段有2个插入方向2个酶切位点消失,3）平端的连接,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,4）不同粘性末端的连接：补平与切平,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,G,ACGTC,3,T4-DNA ligase,5,5,PstI,3,T4-DNA pol,切平,5,5,G,C,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,5,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,退火,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（5突出末端）,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,Pst I,Pst I,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（3突出末端）,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3 G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3,C,退火,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAAAAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,S1,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,加热,5）不同粘性末端的连接：加人工粘性接头（平端）,6）粘性末端的更换,BamHI,5,5,T4-DNA ligase,Klenow,补平,GATCC,5,G,5,G,CCTAG,5,5,5,GGATC,CCTAG,5,GATCC,CTAGG,5,5,GGATCGGAATTCCGATCC,CCTAGCCTTAAGGCTAGG,5,5,EcoR I,GGAATTCC,CCTTAAGG,EcoR I linker,BamHI的位点已被破坏,3、提高重组率的策略,重组率的定义,重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。,提高重组率的策略,1）提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1,2）载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,EcoRI,5,G,CTTAA p,AATTC,G,5 p,5,5,AATTC,G,5 HO,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-A G,5,G A-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸单酯酶,碱性磷酸单酯酶,特别针对单酶切连接,3）加装同聚尾末端：,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATGCCCCCC 3,C,退火,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,