β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法).ppt

-地中海贫血基因检测（PCR-反向点杂交法）,-地中海贫血（简称-地贫）是一种由于-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由-珠蛋白基因点突变所致，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、CDL7(AT)、IVS-654(CT)和TATAbox-28(AG)等位点。因本病多为点突变所致，故常用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。,1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用,【目的】,PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。,【原理】,PCR技术原理,DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。,PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。,【原理】,PCR技术原理,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。,重复循环变性-退火-延伸三过程,每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍,而且这种新DNA分子又可成为下次循环的模板。理论上循环n次，就增加2n倍，即DNA分子数呈指数式增加。当经30次循环后，DNA产量达230拷贝，约为109拷贝。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。,反向斑点杂交技术,反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，具有潜在的临床应用价值。,反向斑点杂交技术原理,【操作步骤】,1.DNA获取（已准备好了）,2.PCR扩增（采用试剂盒）：,反应液管（做好记号）5000rpm，2秒加入 2ul DNA溶液,总体积25微升,反应体系各组分的用量见理论课内容,PCR扩增条件,50，15min95，10min94，1min55，30sec72，30sec72，7min,35cycles,反应条件按照试剂盒要求,影响PCR的因素见理论课内容,3.杂交：,15ml管探针膜条（做好记号）A液 5-6mlDNA溶液（PCR产物）25ul,沸水浴10min,42杂交1.5小时以上,4.洗膜：,50ml塑料管B液 40ml,42 预热,取出膜条，置于50ml塑料管中,42 洗涤15min,5.显色,A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置显色液避光显色20min,杂交反应条件按照试剂盒要求,结果判断,杂交膜条,-28/N标本,-28/-28标本,IVS-II-654/N标本,CD41-42/N标本,CD17/N标本,CD17/IVS-II-654标本,蓝色斑点为阳性杂交信号，因此,N(-)M(+),该位点纯合突变,广泛应用于基因突变检测（如地中海贫血、G6PD缺乏症、耳聋等遗传病的检测）、基因分型、遗传多态性检测以及病原体检测等多个方面，具有广泛的临床应用价值。,PCR-反向点杂交应用,