高美华《医学免疫学》补体结合实验.ppt
50%溶血试验（50%complement hemolysis,CH50）测定血清总补体活性,一、实验原理 补体最重要的活性是溶细胞作用。特异性抗体与红细胞结合可激活补体引起溶血，溶血程度与补体的活性相关。溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线，该曲线在30%70%之间最陡，几乎呈直线，即此阶段对补体量的变化非常敏感，因此实验常以50%溶血作为判断终点来测定血清总补体活性，这一方法称为补体50%溶血实验（CH50）。,二、试剂1、绵羊红细胞（SRBC）：无菌采静脉血，除去纤维蛋白后，洗涤配成2%浓度应用。2、溶血素：抗绵羊红细胞抗体，需提纯后灭活补体。用稀释缓冲液稀释至2单位。3、稀释缓冲液：PH7.4巴比妥缓冲液,三、方法1、待检标本的处理：取试管一支加待测血清0.20ml，加入3.80ml pH7.4巴比妥缓冲液，使血清为1：20稀释。2、取1列10支试管，从110编号，第19为测定管，第10管为对照管。按表进行加样。3、50%溶血标准管 全溶管：2%SRBC 1ml+4ml蒸馏水混匀静置10min 50%溶血管：2ml全溶管液体+2ml pH7.4巴比妥缓冲液。4、上述所有试管经2500rpm，离心5min后，与50%溶血管肉眼初步比较，取较接近的2管进行比色，确定最接近50%溶血管的管号。,四、结果判断：根据最接近50%溶血管的管号，查出该管所加待检血清标本量，按下列公式计算：CH50（U/ml）=1/50%溶血管的血清用量（ml）稀释倍数正常范围：50100 U/ml,补体结合试验（complement fixation test，CFT）,一、原理 Ag和相应Ab反应所形成的免疫复合物（IC）能吸附（固定）并激活补体。5种成份分属于：反应系统；补体系统；指示系统。反应、指示系统竞争结合补体系统。先加入反应系统，优先结合补体。若反应系统中待测的Ab（或Ag）与已知Ag（或Ab）相对应，则Ag与Ab形成IC后可结合补体；再加入指示系统时，因已没有游离的补体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。若不相对应，将会有游离的补体参与指示系统的反应，最终会出现溶血现象，为阴性。,补体结合试验图示,受检系统,指示系统,溶血反应,补体结合试验,1、仅有抗原或抗体,补体,红细胞,溶血素,阳性,阴性,2、抗原抗体反应,红细胞,溶血素,阴性,阳性,抗原,抗体,补体,抗原/抗体,二、试剂1、受检抗原、抗血清（56 30min灭活，1:50稀释）。2、补体（豚鼠新鲜血清，2u）、1%绵羊红细胞（SRBC）、溶血素（2u）。3、生理盐水、试管、吸管、水浴箱等。,三、方法1、溶血素效价的滴定按照下表操作以显示全溶的溶血素最高稀释度作为溶血素的效价。在补体结合试验时，溶血素的效价也称之为1个溶血素单位，在正式试验时一般采用2个溶血素单位。,管 溶血素 2 单位 pH 7.4巴 2羊 号 稀释度溶血素补 体 比妥缓冲红细胞假定结果 1 1:300 0.25 0.15 0.85 0.25 放全溶2 1:400 0.25 0.15 0.85 0.25 置全溶3 1:500 0.25 0.15 0.85 0.25 37全溶4 1:600 0.25 0.15 0.85 0.25 全溶5 1:800 0.25 0.15 0.85 0.25 水全溶6 1:1000 0.25 0.15 0.85 0.25 浴全溶7 1:1200 0.25 0.15 0.85 0.25 30全溶8 1:1600 0.25 0.15 0.85 0.25 分微溶9 1:2000 0.25 0.15 0.85 0.25 钟微溶10 1:2400 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶11 1:3200 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶12 1:4000 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶13 1:4800 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶14 1:6400 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶,2、补体滴定：一般用豚鼠补体，每次试验前均应滴定按照下表操作以能产生完全溶血的最少量的补体为1个“恰定单位”，全溶第2管为1个“实用单位”。正式试验时使用2个实用单位。,补 体 效 价 滴 定,注:为了排除抗原或抗体的抗补体作用，需在补体滴定的同时加入抗原或抗体（如待检系统中以抗原测定未知抗体，需加入抗原，反之则加抗体）。注:指稀释好的每2单位溶血素与等量2绵羊红细胞悬液混合，置室温作用2030分钟即可。,效价计算：从上表可以看出：0.06ml 1:60稀释的补体为1个“恰定单位”，0.08ml为1个“实用单位”。补体结合试验用2个“实用单位”，则0.16ml 1:60稀释补体相当于2个“实用单位”。由于正式试验时所加入的补体量为0.2ml，因此需按下公式算出所用补体的稀释倍数。0.082：600.2：X 600.2 X75 0.082 即将豚鼠血清用pH 7.4巴比妥缓冲液作1:75稀释后，每0.2ml中含2个实用单位的补体。,3、抗原和抗体的滴定：一般采用方阵滴定法，选择抗原与抗体均呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（或单位）。正式试验时，抗原一般用24个单位，抗体采用4个单位。,4、补体结合正式试验 按照讲义的表操作应作抗原或血清对照管，SRBC、溶血素对照管。,四、结果观察1、管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。2、第2、3、4管为对照管均应溶血，第5管为绵羊红细胞对照不应溶血。凡第1管红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，而不溶血者为阳性。,五、实验报告掌握实验原理，记录并分析实验结果。,溶血空斑形成实验（Plaque Forming test，PFT）小室液相法,一、原理 小鼠溶血空斑形成试验：取用绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞悬液，与SRBC和补体混合，灌入用玻片制备的透明小室中，孵育后脾细胞可产生抗SRBC抗体与其周围的SRBC结合，在补体的作用下，即可溶解SRBC而形成透明溶血区。检测实验动物抗体生成细胞产生IgM的能力。,二、器材与试剂1、拨片、双面胶2、细胞培养板、细胞筛等3、SRBC、豚鼠血清（补体）,三、方法1、免疫小鼠2、制备脾细胞悬液3、制备10%SRBC4、补体制备5、制备液相小室6、正式实验按讲义混合小室液，用毛细滴管灌入小室，灌满为止，用石蜡封边，37 孵育1.5小时。,四、结果判断用肉眼计数小室的空斑数。计算20l脾细胞所形成的空斑数，设为X1。则；250：300=计数小室空斑数：X1再计算全脾细胞所形成的空斑数，设为X2。则：20：6000=X1：X2空斑形成率=全脾细胞所形成的空斑数/全脾的脾细胞数X100%,
