高级生物化学PPT课件-蛋白质的研究方法.ppt

1,蛋白质的研究方法,2,主要内容,蛋白质对象的选择和样品的获取蛋白质的检测和鉴定蛋白质的结构分析蛋白质生物功能检测,3,蛋白质对象的选择和样品的获取,4,一、研究对象的选择无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同的蛋白质分子；在一种生物组织中，同时存在着多种蛋白质组分。虽然它们都具有肽链结构，但在分子大小、极性以及电荷上会有所差异。,5,选择研究蛋白的原则：在组织中含量比较高 相对比较稳定的蛋白质（如血液中的Hb；肌肉中的 肌球蛋白和肌动蛋白等）从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体内都还有大量的蛋白质（50左右）从来没有被研究过。,6,获取蛋白样品的方法：直接从生物组织中提纯蛋白为主根据基因组测序获得的信息,7,应用各种分辨效果好的化学及物理化学方法,8,直接从生物组织中提纯蛋白蛋白质的分离纯化包括以下过程：1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；2.将有关的蛋白质分级沉淀下来;（盐析法或有机溶剂法）3.应用层析法或电泳法使它们各自分开；4.蛋白质结晶；5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。,9,根据基因组测序获得的信息（1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获 得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白,10,（2）去获得有关基因的cDNA全序列，然后通过重组DNA技术去表达重组蛋白。有偏差，甚至完全是假象。即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的RNA加工，翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。,11,制备过程中注意事项：要求自始至终保持在天然状态 避免一切过激因素-如过酸或过碱，高温，重金属等的影响。2.通常都在低温条件下操作。3.尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。,12,二、细胞的破碎 少数蛋白质-存在于细胞外面（如血液和体液中）大多数蛋白质-都存在于细胞的里面。一般固形生物材料首先都必须加以破碎，以释放出细胞内的蛋白质组分。生物材料 必须新鲜要求：1.材料-80 2.或者制成干粉 3.低温存放,破碎的方法：机械破碎法：利用机械力的搅切作用，使细胞研碎高速搅切器、玻璃匀浆器、家用搅肉器、研钵、玻璃珠高速匀浆器以及静压器（高压破碎）。2.渗透破碎法：利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。红血球放于水中，便发生自溶。,14,3.交替冻融法：生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。4.超声波法：利用超声波震荡，使细胞膜上所受张力不均而解体。5.酶消化法：利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等对细胞膜或细胞壁的分解作用，使它们解体,15,按其所在位置大体可分为：两种类型外周蛋白（通过次级键和外膜脂质的极性头螯合在一起）固有蛋白外周蛋白-选择适当离子强度及pH的含有EDTA的 缓冲液抽提（高盐溶液）固有蛋白-嵌合在膜双层中，它通过疏水作用与 膜内部脂质层的疏水性尾部相结合，具有螺旋结构。,三、去污剂处理溶解膜蛋白,膜蛋白的处理：复杂,细胞膜的结构,17,膜固有蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。,去污剂：一类具有 亲水性头部 疏性尾巴 的双亲性（amphipathic）脂类分子作用：既可以破坏细胞的磷脂双层结构，又可以与具有疏水性表面的膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋白通过疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集体。,19,有的去污剂的亲水性头部可离子化（即含有一带电基团）如：脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）有的去污剂不能解离，所以分子中缺少带电基团，如：Triton X-100，辛基葡萄糖苷(octylglucoside）,20,临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC)：每一种去污剂都具有一特征性的CMC。CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的结构有 关。当去污剂低于此值的时候，去污剂分子在水溶液中将不形成微团，达到此值的时候，微团开始形成。,21,离子化去污剂（SDS）：其“疏水尾巴”破坏蛋白质分子的疏水性部分的结构，其带电的“头部”破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。作用的结果是：使任何蛋白（不管是膜蛋白还是水溶性蛋白）都发生完全变性，并溶解在水溶液中，同时失去生物活性。在部分情况下，当去污剂被透析掉后，蛋白质可以复性并恢复生物活性。,22,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白完全变性的特性。这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。,23,非离子去污剂：相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。当去污剂其CMC值的时候，去污剂分子将与膜磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的形式存在。一般选择非离子去污剂来保持膜蛋白生物活性,25,四、蛋白分子的稳定防止蛋白质分子可能被同时释放的蛋白质水解酶降解、Pr空间结构可能被温度或化学试剂等环境因素破坏而丧失生物学活性等。处理：需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂；在低温下操作；加入稳定剂(如甘油等）,26,五、细胞碎片的去除离心(centrifugation)原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的底部形成；上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保留在细胞抽提液中即上清中,27,六、目标蛋白质的分离、纯化-蛋白质的分级沉淀和层析分离将不同蛋白质分开的性质主要包括：分子量的大小 带电情况 水溶性 与某种物质的特异高亲和力等,28,蛋白质的胶体性质：蛋白质颗粒表面多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面成有一层水膜，蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。此外，蛋白质表面可带有电荷，可起胶粒稳定的作用。若去除蛋白质胶体表面电荷和水化膜两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中析出,29,#,30,（一）蛋白质的分级沉淀 常用的方法有：盐析法 有机溶剂法,31,盐析法 概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及pH不同，加入不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用，适用范围十分广泛。缺点：分辨能力差,32,1.基本原理在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生两种影响：(1)盐离子与Pr分子中的 极性基团 离子基团 作用 降低Pr分子的活度系数，趋使其溶解度。(2)盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活 度降低，导致Pr水合程度的减少，从而趋使Pr溶 解度。,33,*盐溶（salting in)-当溶液中的盐离子强度比较低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而增加，这种现象叫做.*盐析（salting out)-但当溶液中的盐离子强度比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的增加而降低，这种现象叫做.一定的盐浓度下，每一种蛋白都有一不同的特异溶解度。,34,影响盐析作用的因素（1）盐的种类（2）pH和温度#（3）蛋白质浓度%,35,（1）盐的种类对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力也愈强:PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br-I-K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+负离子价数较高的中性盐（如硫酸盐、磷酸盐等）的Ks值常较一价中性盐的Ks值高。Ks:盐析常数（价数较高时，Ks 值也较大）。代表盐析的效率，是与Pr及盐种类有关的特性常数。,36,硫酸铵（常用盐析剂）优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度 价格低廉 不产生副作用。缺点：缓冲能力较差 pH难控制,37,（2）pH和温度S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度 除取决于Pr的种类，还受pH及温度影响:pH=pI时，S。的数值极小 S。随温度增加而减低。盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出。#,38,（3）蛋白质浓度 Pr较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。Pr较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。,39,蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。但蛋白质浓度愈高时，其他蛋白质的共沉淀作用 也愈强 所以当蛋白质溶液太浓时，应适当稀释，通常在2.53.0之间比较合适。,40,1.基本原理（1）在pI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了 中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。（2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也 促使Pr变得不稳定而聚集析出.常用的有机溶剂：乙醇和丙酮,有机溶剂法 分辨力比盐析方法高，提纯效果好,41,2.影响有机溶剂沉淀Pr的因素（1）pH值 pH=pI时 蛋白质的溶解度最低。按pI来调节pH值，有利于分离。（2）蛋白质浓度 Pr越高，加入一定量有机溶剂后，Pr析出越多。此时溶液的介电常数也相应提高，可以减少Pr的变性。Pr越高,Pr分子间作用引起的共沉淀现象也显著 增强，这样分离效果差，不利于分级沉淀。只有选择恰当的Pr才有可能获得良好的分离效果。,42,（3）离子强度 中性盐的加入能促使Pr在有机溶剂中溶解，并且能防止Pr的变性。但含盐过多，却会使Pr 过度析出，不利于分级沉淀。一般0.05M的稀盐溶液。（4）多价阳离子 Pr与多价的阳离子如（Zn2+、Cu2+等）能结 合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使Pr 溶解度变小。,43,常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在04低温下进行，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。缺点：易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。,44,(二）蛋白质的层析分离法（色谱法）,原理层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。,45,层析分离能力的实质物质的分配问题*分配系数：当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和移动相两相内的浓度之比是一个常数，这称为分配系数。Cs Cm*质量分配系数：若不用浓度而用物质的绝对量的比值来表示，则称为质量分配系数即：Vs Vm Vs:固定相的体积 Vm:流动相的体积,K=,D=K*,46,种类：气相层析 按两相状态来分 液相层析 吸附层析 分配层析 按层析机理来分 离子交换层析 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 按操作方式来分 薄层层析 纸层析层析法分离、纯化：Pr、多肽和AA,47,离子交换层析法*原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。,48,49,固定相：1.纤维素-二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤维素）、羧甲基纤维素（CM纤维素）2.葡聚糖,50,纤维素:骨架为柔性长链1.加入量：加入层析柱的蛋白质量通常为纤维素量的 十分之一。2.提高分辨率，样品体积应尽可能地少。3.在洗脱时，可以通过改变洗脱缓冲液的pH，而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下来，也 可以通过提高洗脱缓冲液中离子强度，减弱 蛋白质分子与载体亲和力的办法，将蛋白质 组分逐一洗脱下来。,51,葡聚糖的离子交换树脂:骨架为三维网状结构 优点：1.同时具有分子筛的作用2.因其高度的网状结构，所带有的交换基团也比纤维 素多得多。交换容量为离子交换纤维素的35倍。缺点：它的床体积常受pH或盐浓度影响而变化，对分离效果有一定程度的干扰。,52,凝胶（排阻）层析又称分子筛或凝胶过滤（gel filtration）原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的 分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱 内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先 洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而 达到相互分离的目的.,53,54,用作凝胶的载体物质有三类：交联葡聚糖凝胶 商品名为 Sephadex G 聚丙烯酰胺凝胶 商品名为Bio-gel P(丙烯酰胺+N，N-次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P值表示不同的交联度)琼脂糖凝胶 商品名为 Sepharose或 Bio-gel A（从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级成分 是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间重复结 合而成的链状化合物）,55,56,琼脂糖凝胶优点：1.其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶好得多。2.对蛋白质等高分子的吸附作用也小得多3.适用分子量的范围宽，最大可以到108。,57,吸附层析法原理：柱层析中，含有Pr分子的混合物随流动相通 过由吸附剂组成的固定相时，Pr分子通过各 种次级作用能够吸附在吸附剂上,由于不同分 子的吸附能力不同，可以通过洗脱使它们逐 一解脱出来，而使混合物得以分离。优点：1.物理吸附，吸附能量比较低，洗脱也比较容易。2.操作简便，吸附剂容易获得，价格较低廉,58,固定相：吸附剂磷酸钙凝胶磷酸钙胶Ca3（PO4）2磷酸氢钙胶CaHPO42H2O羟基磷酸钙胶Ca5（PO4）3OH 羟基磷灰石磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理:主要是由于.Ca2+与Pr负电荷性基团 结合。.磷酸基团与Pr正电荷基团,59,流动相：洗脱剂-柠檬酸盐作用：柠檬酸离子因与Ca2+有更强的相互作用，它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附能力。NaCl，KCl甚至浓度高达3M时，也不影响Pr负电荷的吸附，相反这些盐可以大大降低Pr正电荷的吸附。因此在高浓度的这些盐溶液中应用羟基磷灰石进行层析时，可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白质。,60,亲和层析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。如，酶的活性部位能和底物抑制剂辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除.酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间。这些被作用的对象物质称之为配基（ligand)。,61,固定相-配基固定在固相载体上,62,63,2.优点：具有高度的吸附专一性 层析过程简便、快速3.载体的选择：(1)必须具有高度亲水性，使Pr分子容易与它接近.(2)非专一性吸附要十分小。(3)必须具有大量可供活化而能与配基结合的基团。常用载体：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。,64,高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。,65,HPLC包括：输液系统：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统 层析柱：分离样品中的各个物质 进样器：将待分析样品引入色谱系统 检测系统：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号，并分析显示出来,66,67,蛋白质的检测和鉴定,68,一般可通过以下几个方面进行：光谱学特性 电泳行为 特异抗体反应 特异生物学活性 N一末端氨基酸序列测定 质谱检测 排阻层析,69,一、光谱学特性 光谱特性的总原则是：当一定波长的光（即电磁波）与Pr分子接触时，所吸收的或反射的辐射能量与Pr分子结构特征和浓度是密切相关的。,70,不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反映的是蛋白质分子的不同特征:190-200nm波长范围的光吸收反映的是蛋白质主链上的酰胺键中电子的被激发；230-300nm波长范围的光吸收谱（最大吸收值在280nm波长处）反映的是蛋白质分子中芳香族氨基酸侧链上电子的被激发。所以一般情况下，溶液在280nm波长处（属紫外光范围）的光吸收能力被当做是存在蛋白质的证据。,71,二、电泳检测 蛋白质分子为两性电解质，在不同pH的溶液中带有不同的电荷，从而在直流电场中能够泳动，这就是电泳现象。按介质状态来分:自由电泳 区带电泳按操作原理可分为:一般电泳 等电电泳 等电聚焦电泳 免疫电泳等,72,自由电泳-以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离 缺点:自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限区带电泳-在固体支持物上所进行的电泳 固体支持物有:滤纸、醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 优点:分辨率很高。,73,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS(十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂(Sodium dodecyl sulfate,SDS)SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其分开。这时，若以分子量的对数（logM）对相对于染料前沿的迁移率（Rf）作图，呈现线性关系。,74,75,这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的分子量范围：5胶浓度时，适用于分子量6200万的区间；10胶浓度时，适用于分子量1.67万的区间；15胶浓度时，适用于分子量1.24.5万的区间。,等电聚焦电泳（isoelectric focusing,IEF）是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度。pH梯度制作利用的两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,77,Pr分子有一定的pI，它处在一个由阳极到阴极梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦”在与其pI相同的pH位置上。pI不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。,78,优点：1.有很高的分辨率；2.可以区分等电点只有 0.01 pH单位差异的蛋白质；3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；4.对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。,79,双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳-pI第二向采用SDS一PAGE电泳-分子量 由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率可同时分析成千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。是蛋白质组学研究的核心技术。,80,双向PAGE,81,双向电泳技术缺点，具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：等电点（pI)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白质；分子质量很大的蛋白质，比如大于l00kDa的蛋白质就比实际的少了，而大于150kDa的蛋白质就几乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些大蛋白质都能清楚地被观察到；疏水性蛋白质。,免疫电泳 将电泳分离和专一性免疫沉淀相结合的分析方法：免疫电泳法是指利用凝胶电泳与双向免疫扩散两种技术结合的实验方法。在电场作用下标本中各组分因电泳迁移率不同而分成区带，然后沿电泳平行方向将凝胶挖一沟槽，将抗体加入沟槽内，使抗原与抗体相互扩散而形成沉淀线。根据沉淀线的数量、位置及形状，以分析标本中所含组分的性质。,由于免疫反应有很高的专一性，可用于鉴定Pr的纯度，分析样品中蛋白质的组分。,PH 8.6,本实验常用于抗原分析及免疫性疾病的诊断。,83,84,三、测定纯化蛋白质的分子大小 测定蛋白处于非变性条件下的大小一般可通过：凝胶层析沉降平衡超速离心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation)动态光散射（dynamic light scattering)孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（pore gradient polyacrylamide gel electrophoresis）,85,凝胶层析,1.凝胶是一类多孔性高分子聚合物,每个颗粒犹如一个筛子.当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱;2.反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱.,86,3.而中等大小的分子,它们也能在凝胶颗粒内外分布,部分进入颗粒,从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱.这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。VeblogMw C其中b,C为常数。即Ve为洗脱体积，与logMw也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。,87,沉降平衡超速离心（sedimentation equlibrium ultracentrifugation)用该技术测定蛋白质分子质量的时候，测定的是几个绝对动力学参数。,原理：当Pr样品在相对较低的离心速度（但还是处于超速范围）下离心时，在一个从离心管顶部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，Pr分子很快形成一个从离心管顶部往下逐渐增加的连续r浓度梯度；与此同时，将有一个方向与离心力相反的扩散力作用于Pr上；当沉降离心进行一定时间之后，作用于Pr上的离心力和扩散力（前者与蛋白在离心管中所在位置离轴心的距离成正比例，后者与Pr浓度成正比）正好相互消除，这样使得蛋白样品的表面处于一个平衡状态而不再移动.在这种平衡条件下，不同部位Pr浓度与所在部位离轴心的距离之间的关系与蛋白质分子质量成某种数学关系。正是通过这种关系，可以测定蛋白质的分子量。,89,90,动态弹性光散射 是通过测定蛋白颗粒的直径、然后与标准蛋白样品比较而推算蛋白分子质量的方法。这种测定技术也可通过观察样品是单分散性的（monodispersed）还是多分散性的（polydisper-sed）而反映所测蛋白样品是否均一。,91,孔径梯度电泳 这是通过制备具有一定范围的从大到小孔径梯度的聚丙烯酸胺凝胶，然后让蛋白在非变性条件下在这种凝胶上电泳而进行的。经过低电流条件下的较长时间的电泳，蛋白质分子将在凝胶中与其直径相等的孔径处停下（因为再往下凝胶中的孔径比蛋白直径小）。通过与同时在胶中电泳的标准样品比较我们就可以知道蛋白在这种非变性条件下的分子质量。优点：.所获得的是天然状态下的蛋白分子大小。2.如果蛋白分子能够在这种低电流电场中长 时间保持稳定的话，这种方法比 较经济。,92,质谱 质谱是一种在化学中被广泛采用的、测定原子或分子质量方法中最直接、最准确的方法。,93,用质谱测定蛋白质分子质量的总的原理：首先纯化好的蛋白样品要被转变成挥发和带电（即解离）状态，电离后的蛋白质分子（带有多个电荷）然后进人一个真空加速电场中，之后，不同质荷比（m/z）的蛋白分子表现出的行为或者在外加磁场中的偏转、或者抵达固定探测器的所谓“飞行时间（time of flight,TOF)不一样。利用所测得的质荷比以及蛋白所带的电荷值，计算机软件很快就会正确地给出所测蛋白分子的质量。,94,用质谱测定蛋白质的分子质量，精确一般可达0.01%，是目前进行蛋白质分子量测定最准确的方法（其准确度超过SDS-PAGE、弹性光散射和孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳，甚至分析超速离心等）。质谱技术现在也可直接用于：氨基酸序列的测定蛋白质的翻译后修饰的鉴定蛋白质组学研究工作。,95,四、测定蛋白质的氨基酸序列蛋白质被纯化出来，需要进一步获取其基因序列，最好测定其部分的或全部的氨基酸序列。自动氨基酸测序仪,96,五、用抗体探测特异蛋白质分子抗体是当外源入侵物（包括蛋白质）与脊椎动物体内的免疫系统接触后产生的、能与入侵物特异结合的防御性蛋白质分子。这种高度特异、高度灵敏的抗体一抗原结合反应现在被广泛地应用于检测微量蛋白的存在情况。,97,目前应用抗体研究蛋白质的方法主要包括下面几种：.蛋白质印迹 2.免疫共沉淀,98,(一）蛋白质印迹（Western blotting）是一种使用广泛的检测蛋白质的方法。这种方法与研究核酸时用的印迹法原理非常类似蛋白质印迹法是利用抗原一抗体之间的特异结合反应而检测的；核酸类的印迹法是利用核酸分子之间通过特异碱基配对法则而形成杂交分子这一原理而检测的,99,蛋白质印迹检测时，蛋白质混合物（一般是细胞抽提物）通过电泳被分开，蛋白质被（一般通过电场的作用）转移到一种特别的膜（如硝化纤维膜等）上，然后让特异的抗体与固定在膜上的特异抗原蛋白结合抗原一抗体之间结合的高度特异性使得用某种蛋白质分子制备的特异抗体分子只与膜上的这种蛋白质分子结合，而不与膜上存在的成千上万种其他蛋白质发生相互作用。,100,结合了特异抗体的蛋白质条带可以通过能与结合在抗原蛋白上的所谓“第一”抗体结合的、被一种特异的酶化学发光基团荧光基团放射性同位素标记的“第二”抗体进行显示。这样我们可以知道与特异抗体对应的抗原蛋白在检测的蛋白混合物中是否存在？相对量是多少？如果蛋白混合物是通过SDS-PAGE分开的话，被检测蛋白的分子量也一目了然。,101,（二）免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子之间是否存在特异相互作用的方法。免疫共沉淀的原理：如果两个蛋白在体外系统中能够发生特异相互作用的话，那么当用两个蛋白中的一个所对应的抗体进行免疫沉淀的时候，另一个蛋白也将同时被沉淀下来。,102,蛋白质的结构分析,103,蛋白质结构包括：共价结构和非共价结构静态结构和动态结构。一级结构空间结构,104,一、氨基酸序列测定一级结构的测定蛋白质的一级结构决定其高级结构，测定一个蛋白质的一级结构是我们认识一个蛋白质结构和功能的前提之一。,105,Edman降解法：是肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔埃德曼（Pehr Edman）首先创立。质谱技术基于串联质谱技术的测序方法是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性这一特点而设计的 通过测定蛋白质的氨基酸所对应的DNA编码序列上读出（从cDNA序列直接读出，或从对应的基因组DNA序列中的外显子序列）,106,Edman降解法：,原理：首先用标记N末端残基的试剂苯异硫氰酸（PITC),在碱性条件下，与肽链N末端自由的氨基偶联，生成苯氨基硫甲酰基衍生物（PTC-肽）。然后PTC-肽在酸性中经裂解，环化生成苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）和剩余多肽(N端少一个氨基酸的多肽）。通过用HPLC或电泳法分析PTH-氨基酸，可以鉴定出是哪一个氨基酸。每反应一次，结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下一个循环，继续发生降解。,107,优点：能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列，最多可以分析50-60个氨基酸残基。在最好的条件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，缺点：由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的，因此当N-端被其他化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。此外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧化为SO3H，然后才能用Edman降解测定序列。,质谱技术测定序列：.先测定某一肽段（如：A-B-C-D-E-F-G-）以及从C一末端或N一末端去除一个残基的同一肽段（如：B-C-D-E-F-G-）各自的分子质量，二者之差值即为末端残基（A）的分子质量。2.然后与20种标准氨基酸的分子量进行比较就可以确定末端氨基酸的本质了。在实际操作的时：从质谱上得到的是一系列的多肽片段，每对大小相近的片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。根据这一分子量差值的大小，较大肽段的末端残基即可准确判断。换句话说，从获得的一系列依次相差一个残基的肽段的分子质量中我们很快就可以确定最初样品多肽的末端序列（从N一末端或C一末端开始）。,109,二、蛋白质空间结构的测定最为成熟的方法是：X一射线晶体衍射法1953年J.D.Watson和F.H.C.Crick根据X-射线衍射实验建立了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构.获得了1962年的诺贝尔生理学和医学奖.另一项是用X-射线衍射分析方法测定肌红蛋白和血红蛋白晶体结构的工作。另一个方法为磁共振（NMR),X-射线晶体衍射法基本原理：首先，纯化的蛋白质分子在合适的环境中进行高度有序的排列而形成所谓的单晶（single crystals)；然后，用一束X射线（波长为1.54埃左右的电磁辐射）照射蛋白晶体中按同样方式排列的巨大数目的蛋白分子。结果，一部分射线将在与蛋白分子中精确排列原子的电子云发生相互作用后散射（scatter)，或说衍射diffraction)。在距离蛋白晶体一定的位置放置一个对X一射线敏感的电子探测器（detector)，则可以得到一个反映蛋白质分子中不同原子排列方式的衍射图（diffraction pattern)。通过利用计算机软件处理后转换成一电子密度图，根据所得到的电子密度图即可解出晶体蛋白分子中的每一个原子的排列方式。,111,三、蛋白质构象变化的追踪 蛋白质分子在折叠、去折叠过程中，在与其他分子发生相互作用的时候都会发生构象的调整。这些变化一般可通过圆二色谱(circular dichroism,CD）等方法来探测。红外光谱（Infrared spectroscopy)、拉曼光谱(Raman spectroscopy)、电子自旋共振(electron spin resonance,ESR)等也都可以从不同角度对蛋白质分子构象的变化进行定性或（和）定量探测。,112,四、蛋白质分子的生物功能研究（一）基因敲除技术 利用重组DNA技术将编码某种蛋白的基因从有机体基因组中敲除掉，观察缺失该蛋白的个体出现的表型变化，然后再推测蛋白在体内的可能功能。（二）细胞转染技术 将编码某种蛋白质的目的基因（真核生物中一般使用的是对应蛋白质的cDNA序列）插入到一DNA载体上，使之能够在待转染的细胞中表达，产生出具有活性的蛋白质分子。然后观察转染后，所产生的蛋白质对被转染细胞的行为的影响。并进而推测蛋白质在细胞内的可能功能。,113,（三）酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是通过遗传学方法鉴定两个蛋白质分子之间在酵母细胞内是否发生特异相互作用的有效手段。若两个蛋白质发生这种特异的相互作用的话，那么可以认为它们之间的功能可能存在某种相关性。如果相互作用的两个蛋白质分子中有一个的功能已知的话，那么就为我们认识另一个蛋白分子的生物功能提供了重要的暗示。,114,115,蛋白质研究方法复习题,1.简述蛋白质的分离纯化过程。2.去污剂的作用及分类3.盐析的原理。盐溶 盐析4.离子交换层析和凝胶排阻层析的原理。简述常用作凝胶的载体物质的种类5.等电聚焦电泳的原理6.蛋白质印迹7.简述Edman降解法8.举例说明蛋白质生物功能研究的方法。,