宋存江《微生物发酵工程》第9章灭菌工程.ppt

第九章 灭菌工程,一.灭菌原理和方法二.培养基灭菌三.湿热灭菌原理及影响灭菌因素四.影响培养基灭菌的因素？五.分批灭菌的设备与计算,培养基灭菌是否彻底直接关系到生产过程的成败,轻则导致所需要的产品质量锐减,质量下降,后处理困难,重则使全部培养液变质,导致成吨的培养基报废,造成巨大的经济损失。主要不良后果包括:,第九章 灭菌工程,(1)杂菌污染,使生产反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失,造成生产能 力的大幅下降;(2)杂菌产生代谢产物,或在染菌后改变培养液的某些理化性质,使产物的提取和分离变得非常困难,造成收率降低或产品质量大幅下降;(3)杂菌会大量繁殖,改变反应介质的pH值,从而使生物反应发生异常变化;(4)杂菌可能会分解产物,从而使生产过程失败;(5)发生噬菌休污染,微生物细胞被裂解,而使生产失败。,工业上培养基,发酵设备一般采用蒸气灭菌,空气采用过虑除菌。,化学试剂灭菌法 电磁波,射线灭菌法(电磁波波长和杀菌的关系见下页图)干热灭菌法 湿热灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法 红外线灭菌 微波灭菌法(各种灭菌方法的特点以及适用范围见下下页表),常用的灭菌方法,一.灭菌原理和方法:灭菌是利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。,电磁波的波长和杀菌作用关系,过 滤 谱,膜过滤法是指以压力为推动力，依靠膜的选择性，将液体中的组分进行分离的方法。包括：微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)和反渗透(RO)。微滤、超滤、纳滤和反渗透四者既有联系又有区别。共同点是：末的制造方法基本类似，结构类似，操作方法类似;不同点是：适用范围不同，MF：0.02-10.0 m;UF:0.001-0.02 m或1000-300,000DaltonNF:200-1,000 Dalton或1nm左右；RO:350 Dalton,膜过滤除菌法,红外线灭菌（infrared sterilization）红外线辐射是一种0.77-1000微米波长的电磁波，有较好的热效应，其中1-10微米波长的热效应最强。可进行灭菌。红外线由红外线灯泡产生，不需要经空气传导，所以加热速度快，但热效应只能在照射到的表面产生，因此，不能使一个物体的前后左右均匀加热。红外线的杀菌作用与干热空气相似，利用红外线烤箱灭菌的所需温度和时间与干热灭菌相同。多用于医疗器械的灭菌。人受红外线照射较长会感觉眼睛疲劳及头疼；长期照射会造成眼内损伤。因此，工作人至少应戴能防红外线伤害的防护镜进行操作。,微波灭菌(microwave sterilization)微波是一种波长为1毫米到1米左右的电磁波，频率较高，可穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表面。微波能使介质内杂乱无章的极性分子在微波场的作用下，按波的频率往返运动，互相冲撞和磨擦而产生热，介质的温度可随之升高，因而在较低的温度下能起到消毒作用。一般认为其杀菌机理除热效应以外，还有电磁共振效应，场致力效应等的作用。消毒中常用的微波有2450MHZ与915MHZ两种。微波照射多用于食品加工。在医院中可用于检验室用品、非金属器械、无菌病室的食品食具、药杯及其它用品的消毒。微波长期照射可引起眼睛的晶状混浊、睾丸损伤和神经功能紊乱等全身性反应，因此必须关好门后才开始操作。,微波灭菌原理 微波灭菌的机理在于，细菌、成虫与任何生物细胞一样，是由水、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂肪和无机物等复杂化合物构成的一种凝聚态介质。其中水是生物细胞的主要成分，含量在7585，因为细菌的各种生理活动都必须有水参与才能进行，而细菌的生长繁殖过程，对各种营养物的吸收是通过细胞质膜的扩散、渗透和吸附作用来完成的。在一定强度微波场的作用下，物料中的虫类和菌体也会因分子极化排序，同时吸收微波能升温。由于它们是凝聚态物质，分子间的作用力加剧了微波能向热能的能态转化。从而使体内蛋白质同时受到无极性热运动和极性转动两方面的作用，使其空间结构变化或破坏，而使蛋白质变性。蛋白质变性后，其溶解度、粘度、膨胀性、渗透性、稳定性都会发生明显的变化，而失去生物活性。另一方面，微波能的非热效应在灭菌中起到了常规物理灭菌所没有的特殊作用。也是造成细菌死亡的原因之一。,灭菌消毒 试验表明，一定强度的微波能在1分钟内杀灭所有大肠杆菌6分钟内杀灭沙氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。当然，使用微波炉进行灭菌消毒，不能达到医学标准的杀灭程度但用于一般家庭的灭菌消毒处理还是具有较好效果的。顺便说明，利用微波炉进行灭菌消毒，掌握好方法要领是很重要的。如对餐具消毒，应将其浸泡在水中或包裹在湿毛巾里进行；如对书籍消毒，最好在炉腔中同时放一杯水，且严格掌握加热时间，防止纸张焦黄；又如对衣物消毒，应在衣物上撒点水，即可提高消毒效果又可防止衣物烧焦。,应该指出的：事实上，质量检测机构只关心微波炉是否存在微波泄漏的情况。令人惊讶的是，这些质量检测机构从未质疑微波食品本身是否安全。1991年，由于一场公众瞩目的官司，人们开始意识到微波食品是不安全的。一位名叫NormaLevitt的妇女的家人为她的误死起诉。Norma去医院进行髋部更换手术。手术很成功，但Norma却死了。Norma死于一次输血之后，血液是经过微波炉加温的。这是第一次有重大证据表明微波炉对被加热的物品的化学性质造成了根本的破坏。如果仅用微波炉把血液加热到体温，就能使血液包含致人于死命的毒性，那么我们用更高的温度在更长的时间内加热食品，又会有什么情况呢？微波炉的作用远不止于把物体加热那么简单。,隧道式微波干燥灭菌机,结构特点：微波干燥灭菌机为多管型隧道式，主要部件均采用不锈钢制选，达到制药设备的GMP标准。整机采用触摸屏和PLC控制，自动化程度高，操作安全方便。设备的核心部件均为国外著名公司生产，质量可靠，使用寿命长。主要用途及优点：微波干燥灭菌机主要用于蜜丸、水丸、水蜜丸、浓缩丸、浸膏、药粉、颗粒等中药固体制剂及原料药和饮片的干燥灭菌；以及口服液、糖浆等瓶装液体制剂的灭菌。还广泛用于食品、化工、木材、纸制品等的干燥、灭菌、防霉。具有干燥速度快、均匀、节能高效、操作简便、易于控制、安全无污染等优点。,小型微波连续式微波干燥灭菌机,主要用途：它是我公司新研制成功的一种小型微波连续式生产干燥灭菌机。其可用于蜜丸、水丸、水蜜丸、浓缩丸等中药固体制剂及原料药材和饮片的干燥灭菌，以及口服液、糖浆等瓶装液体制剂的灭菌；还广泛用于食品、化工、木材、低制品等的干燥、灭菌、防霉。具有干燥速度快，均匀，节能高效，操作简便，易于控制，安全无污染等优点，是研究所、医院及小型生产厂家的理想之选。特 点：本设备拥有独立知识产权，是自行开发研制的新产品，面向科研单位、医院、小型生产厂家和各类企事业单位实验室。此设备为开放型微波加热装置，智能化控制，线性可调，温度自动可控，并可根据用户需求设计制造类似设备。结 构：该产品由微波控制，微波加热控体，无级调速的物料输送，自动化电器控制系统构成单元箱体结构，外形整洁，美观大方。,日本赤星教授把枯草杆菌、大肠杆菌、黄青霉、曲霉等微生物放在各自的培养基中。然后用微波2800MHz，脉宽1s，重复频率2000Hz的脉冲，功率2KW，照射90秒就能杀死。而同样的枯草杆菌用开水15分钟才能杀死。赤星教授又用2450MHz，5KW，12m长传送带加热器进行乌贼保鲜试验。每次用晴纶袋装100g，一次流量3Kg，拆开袋子微波照射3分钟后，一般生菌数由原来每克12到26万个减少至1.4到2.4千个。在工场堆放乌贼生菌数为每克2100万个，开袋照射3分钟后，生菌数减至每克6100个。1965年奥乐森用2450MHz微波辐射面包防霉，在65保温辐射5-10分钟，21天仍呈新鲜状态。据认为青霉和曲霉等霉孢子致死温度为68-71，但微波并未达此温度，霉菌仍被杀死。分析认为：一种可能是在面包保温辐射期间，面包虽未升温，但霉菌体内的盐类溶液可能对微波的选择吸收大，因此菌身温度可能高于面包温度而致死。另一种可能就是微波非热效应作用使细菌致死。,二.培养基灭菌培养基灭菌最基本的要求是杀死培养基中混杂的微生物,再接入纯菌以达到纯种培养的目的。湿热灭菌法在培养基灭菌中具有经济和快速的特点:在高温及存在水分的条件下,微生物细胞内的蛋白质极易变性或凝固而引起微生物的死亡。但是,高温不仅能杀菌,同时也破坏培养基中的营养成分,甚至能产生不利于菌体生长的物质。因此,工业上对培养基灭菌时,除了尽可能杀菌之外,还要尽可能减少培养基的成分损失。常用121 0C 20-30 min1.几个重要的概念热死时间:在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。致死温度:杀死微生物的极限温度。在极限温度下,杀死全部微生物所需要的时间为致死时间。不同微生 物及孢子的致死温度、时间是不一样的。(见下页表),热阻:微生物对热的抵抗力用此概念来表示。是指微生物在某一特定条件下(某一温度和加热方式)的致死时间相对热阻:是指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比例。,芽孢或孢子的热阻要比生长期营养细胞的热阻大,这是芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量对热阻的增加;同时孢子或芽孢中蛋白质含水量比营养细胞低(特别是游离水分少)也是芽孢耐热的原因之一。,非对数死亡规律,对数死亡规律,三.湿热灭菌原理及影响灭菌因素 发酵工业中对培养基和发酵设备的灭菌采用此法，灭菌程度和营养成分破坏是湿热灭菌中的关键,必须恰 当掌握加热温度和受热时间。1.灭菌动力学(1)微生物的死亡速率 对数残留定律:微生物受热死亡的原因是因为高温使微生物体内的一些重要蛋白质发生凝固、变性、如:某些酶类;从而导致微生物无法生存发生死亡。在灭菌过程中,活菌数逐渐减少,其减少量随残留活菌数的减少而递减,即微生物的死亡速率与任一瞬时残留的活菌数成正比,如前页图大肠杆菌的死亡曲线为线性关系,称为对数残留定律,即反映为一级化学反应动力学为:dN/dt=KN N:残存的活菌数;t:灭菌时间(s);dN/dt:活菌数瞬时变化速率,即死亡速率。K:灭菌速度常数(s-1);K也称为反应速度常数或比死亡速度常数,此常数的大小与微生物的 种类与加热温度有关。,前式积分得:N t/N 0=e k t t=1/Kln N0/N t=(2.303/K)lg N0/N t N 0:开始灭菌(t=0)时原有活菌数;N t:经时间 t 后残存活菌数;上式是计算灭菌的基本公式,灭菌速度常数 K 是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的,K值越小,则此微生物越耐热。同一微生物在不同的生理条件,生长条件以及灭菌方法等多种因素的影响下,其营养细胞和芽孢的比死亡速率也有极大差异,就热阻而言,孢子热阻要比生长期细胞大得多。(2)非对数死亡规律 嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢在不同温度下的死亡曲线不符合对数死亡规律,呈现热死亡非对数动力学行为的主要是一些芽孢。,“菌体循序死亡模型”:（Prokop 和 Humphey 所提出）假设耐热性微生物芽孢的死亡不是突然的,而是渐变的,它需经历一个热敏感性的中间过程后才会死亡,这一过程可用 下式表示:NR KR NS Ks ND即:芽孢由耐热的芽孢(R型)转变为死亡的芽孢(D型)的过程中,中间经历了一个对热敏感的中间态芽孢(S型),根据反应力学的原理,它们的变化可表示为:d NR/dt=KR NR d NS/dt=KR NRKs N s 式中:NR：耐热性活芽孢数(R型);N s:敏感性活芽孢数(S型);ND:死亡的芽孢数(D型);KR:耐热性芽孢的比失活速率s-1;Ks:敏感性芽孢的比失活速率s-1;,建立上述微分方程组,可求得其解为:N/N 0=KR/(KR Ks)exp(Ks t)(Ks/KR)exp(KR t)式中:N:任一时刻具有活力的芽孢数,即 N=N s+NR;N0:初始的活芽孢数。如果培养基中含有大量的不耐热(敏感性)微生物和相当数量的耐热性微生物,则灭菌时微生物的残留曲线可成为右图所示的情况.,从上述的微生物对数死亡规律和非对数死亡动力学模型方程式可知,如果要达到彻底灭菌,即灭菌结束时残留的活微生物数等于Nt=0,则灭菌所需的时间应为无限长,这在实际中是不可能的。因此,工程中,在进行灭菌的设计时,常认为：,N/N0=0.001,(Nt=10-3)即在1000次灭菌中,允许有一次失败或灭菌1000罐中残留一个活菌。,2.灭菌的温度和时间:微生物的受热死亡属于单分子反应,其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示:K Aexp(-E/RT)或 lnK=lnA-E/RT 式中:A:频率常数,也称阿累尼乌斯常数,s-1;R:气体常数,8.314 J/molK T:绝对温度,K;E:微生物死亡活化能,J/mol E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量,比值越大,表明微生物死亡速率随温度的变化越敏感；反之，就越不敏感。因此,在灭菌操作中,E/R是一个十分重要的参数。下页表是一些微生物死亡或蛋白质变性时的活化能和死亡或变性速度常数。,以微生物的比死亡速率常数K对温度的倒数(I/T)作图,则可得下图所示的曲线.,培养基加热灭菌时:微生物固然会被杀死,但培养基中的有用成分也会随之遭到破坏,那么有何良策可以即达到灭菌要求,同时又不破坏或尽可能少破坏培养基中的有用成分；实践证明:高压蒸气灭菌情况下,培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏,如1210C,20 min,就有59%的Lys 和Arg及碱性氨基酸被破坏,蛋和色也有相当破坏。,灭菌工程的最高境界,大部分培养基的破坏也可认为是一级分解反应,其反应动力学方程为:dc/dt=-Kc c:培养基内易被破坏成分的浓度,mol/l;t:灭菌时间,s;K:培养基内易被破坏成分的分解速率常数，s-1;在一级反应中,如其它条件不变,则培养基成分分解速率常数和温度的关系 也可用阿累尼乌斯公式表示:K Aexp(-E/RT)或 lnK=lnA-E/RT 式中:A:频率常数,也称阿累尼乌斯常数,s-1;R:绝对温度,8.314 J/molK T:绝对温度,K;E:培养基成分分解所需活化能,J/mol E/R是培养基成分分解时对温度敏感性的度量,此值越大,表明培养基成分分解随温度的变化越敏感;反之,就越不敏感.当培养基受热时温度从T1上升至T2,微生物的比死亡速率常数 K 和培养基成分破坏的速率常数 K 的变化情 况为:,微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培养及成分的破坏速率的增加。100C 化学反应的反应速度的增加倍数是：倍；杀死芽胞速度会增加5-10倍；杀死微生物细胞的速度增加35倍；,一个案例，灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是118灭菌15min，另一种是128 灭菌5min。而培养基中B族维生素的保留值在前一种方式为90%，后一种方式为95%。,由此可见，在高温下灭菌，时间是一个非常重要的因素，下图和表分别表示杀死细菌芽孢与保留B族维生素的时间与温度关系以及在不降低规定的灭菌前提下(N/N0=10-3)，灭菌温度、时间和营养成分破坏量的关系。,灭菌温度、时间与营养成分破坏量的关系(N/N0=10-3),由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。生产实践也证明，灭菌温度较高而时间较短比温度较低而时间较长要好。例如，在140下灭菌，灭菌时间为0.177min，维生素B1的损失为3.95；若灭菌温度升至150，灭菌时间可缩短为0.025min，这时，维生素B1的损失可减至1.0。另一万面，灭菌温度的高低、时间的长短会直接影响到培养基的质量，进而影响到培养过程的水平。据此，可以在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。,(1)培养基成分 培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，微生物的热死亡速率就越慢，这是因为在热死温度下，脂肪、糖分和蛋白质等有机物质在微生物细胞外面形成一层薄膜，该薄膜能有效保护微生物细胞抵抗不良环境，所以灭菌温度相应要高些。相反高浓度的盐类、色素等的存在则会削弱微生物细胞的耐热性，故一般较易灭菌。(2)培养基的物理状态 实践证明，培养基的物理状态对灭菌具有极大的影响，固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长，假如100时液体培养基的灭菌时间为1h，而固体培养基则需要2-3h才能达到同样的灭菌效果。其原因在于液体培养基灭菌时，热的传递除了传导外，还有对流作用，固体培养基则只有传导作用而没有对流作用，况且液体培养基中水的传热系数要比有机固体物质大得多。实际中，对于含有小于lmm的颗粒培养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对于含有少量大颗粒及粗纤维的培养基的灭菌，则要适当提高温度，且在不影响培养基质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以防止培养基结块而造成灭菌的不彻底。,四.影响培养基灭菌的因素,(3)培养基的pH值 培养基的pH值愈低，灭菌所需的时间就愈短。培养基的pH值与灭菌时间的关系可见下表,(4)培养基中的微生物数量 培养基中微生物数量越多，达到要求灭菌效果所需的灭菌时间也越长，下表所示为培养基中不同数量的微生物孢子在105下灭菌所需的时间。,因此，在实际生产中，不宜采用严重霉腐的原料和腐败的水质，因为这类原料中不但有效成分少，而且微生物数量多，彻底灭菌比较困难。,培养基的pH值与灭菌时间的关系,培养基中微生物袍子数目对灭菌时间的影响,由表可知，在一定范围内，微生物细胞含水分越多，则蛋白质的凝固温度越低，也就越容易受热凝固而丧失生命活力。(6)微生物细胞菌龄 微生物细胞菌龄不同对高温的抵抗能力也不同，年老细胞对不良环境的抵抗力要比年轻细胞强，这与细胞中蛋白质的含水量有关，年老细胞中水分含量低，年轻细胞含水量高，因此，年轻细胞容易被杀死。,（5）微生物细胞中水含量微生物湿热死亡的原因主要是由于菌体蛋白质的凝固失活，而蛋白质凝固的温度与水分有密切的关系。下表为卵蛋白凝固时水分与温度的关系。,卵蛋白凝固时水分与温度的关系,(7)微生物的耐热性 各种微生物对热的抵抗力是不同的，细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感，而放线菌、酵母、霉菌孢子比营养细胞的抗热性要强，细菌芽孢的抗热性就更强。一般讲，无芽孢的细菌或霉菌孢子在100以下加热3-5min都可被杀死，但是有些细菌芽孢的热阻较大，100、30min仍未被杀死，所以灭菌的彻底与否应以杀死细菌芽孢为标准。(8)空气排除情况 蒸汽灭菌过程中，温度的控制是通过控制罐内的蒸汽压力来实现。压力表所显示的压力应与罐内蒸汽压力相对应，即压力表的压力所对应的温度应是罐内的实际温度。但是如果罐内空气排除不完全，压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽压力，还包括了空气分压，因此，此时罐内的实际温度就低于压力表显示压力所对应的温度，以致造成灭菌温度不够而灭菌不彻底，如下表所示。,蒸汽压力与温度的关系,（9）搅拌 在整个灭菌过程中，必须保持培养基在罐内始终均匀地充分翻动，使培养基不致因翻动不均匀造成局部过热，从而过多破坏营养物质或造成局部(亦称死角)温度过低而杀菌不透等，要保证培养基翻动良好，除了搅拌外，还必须正确控制进、排汽阀门，在保持一定的温度和罐压的情况下，使培养基得到充分的翻动，是灭菌的要点之一。(10)泡沫 在培养基的灭菌过程中，培养基中发生的泡沫对灭菌极为不利，要注意防止培养基出现泡沫，因为泡沫中的空气形成隔层，使热量难以传递，使热量难以渗透进去，不易达到微生物的致死温度，从而导致灭菌不彻底。泡沫的形成主要是由于进汽排汽不均衡而致。如果在灭菌过程中突然减少进汽或加大排汽，则立即会出现大量泡沫，对极易发泡的培养基应加消泡剂以减少泡沫量。,五.分批灭菌(batch sterilization)的设备与计算,培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基置于发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌或实消(sterilization of medium in fermenter)。在实验室，采用的灭菌器灭菌也是分批灭菌。在工业上，规模较小的发酵罐往往采用分批灭菌的办法分批灭菌无需专门的灭菌设备，设备投资少，操作简单易行，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽的要求低（0.30.4 MPa表压），故较普遍采用。其缺点是加热和冷却所需时间较长，增加了发酵前准备时间，也就是相应的延长了发酵周期，使发酵罐利用率降低。所以大型发酵罐采用这种方法在经济上是不合理的。同时，分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，不可避免地使培养基中营养成分遭到一定程度破坏。但是对于极易发泡或粘度很大难以应用连续灭菌的培养基，即使对于大型发酵罐也不得不采用分批灭菌。,分批灭菌可在所用的发酵罐中进行。将培养基在配料罐中配好，通过专用管道用泵打入发酵罐，开始灭菌。,发酵罐的管路布置,空罐灭菌（空消）(sterilization of fermenter)是发酵罐罐体的灭菌。空消时一般维持罐压在0.150.2 MPa，罐温125130，保持3045 min；要求总蒸汽压力不低于0.30.35 MPa，使用压力不低于0.250.3 MPa。实罐灭菌时，先将输料管路内的污水放掉冲净，然后将配置好的培养基泵至发酵罐（种子罐或料罐）中，同时开动搅拌器进行灭菌。灭菌前先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至8090后，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视镜管也同时进气），使罐温上升到118121，罐压维持在0.090.1 MPa（表压），并保持30 min左右。各路进气要通畅，防止短路逆流；罐内液体翻动要激烈；各路排气也要通畅，但排气量不宜过大，以节约用气量。在保温阶段，凡进口在培养基液面以下的各管道及冲视镜管都应进气；凡开口在液面之上者均应排气。无论与罐相连的管路如何配制，在实消时均应遵循“不进则出”的原则，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保温结束后，依次关闭各排气、进气阀门，立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却。在引入无菌空气前，应注意罐压必须低于过滤器压力，否则物料将倒流入过滤器内，后果严重。灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.30.35 MPa，使用压力不低于0.2 MPa。,六、分批灭菌操作的计算,分批灭菌的过程包括升温、保温和降温三个阶段，如图所示。灭菌主要是在保温过程中实现，升温阶段后期也有一定的灭菌作用。,培养基分批灭菌过程中温度的变化,培养基的升温，可以在夹套或蛇管内通入蒸汽间壁加热，也可以直接将蒸汽通入培养基中，或两者兼用。但直接通蒸汽会因冷凝水的加入改变灭菌后培养基的体积。培养基的保温阶段是灭菌的主要时段。习惯上，把保温时间看为灭菌时间。分批灭菌所涉及的计算主要是灭菌时间计算和热量计算。,分批灭菌时间的计算(batch sterilization time calculation)分批灭菌时间的确定应参考理论灭菌时间作适当延长或缩短。如果仅考虑保温时段的灭菌作用，根据公式：理论灭菌时间 t=1/K ln N0/Nt=2.303/K log N0/Nt，其中K为灭菌速率常数，单位：s-1，取决于灭菌温度和灭菌对象，通常以耐热芽孢杆菌为灭菌对象，K则为灭菌温度的单一函数，其计算如式：,而Nt为灭菌结束时培养基中活微生物数，一般取0.001个，即灭菌失败的概率为千分之一。N0为灭菌开始时培养基中活微生物数，可以参考一般培养基中的活微生物数为每毫升（1-2）107个而取得。,案例 有一发酵罐内装培养基40 m3，在121的温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基中含有耐热菌的芽孢107个，在121时的灭菌速率常数为0.0281 s-1。试求灭菌失败的几率为0.001所需要的时间。,解：,；,从上述案例可以看出一般采用的灭菌条件121和30 min是有理论依据并被实践所证实了的分批灭菌条件。但是，在这里没有考虑升温阶段对灭菌的贡献，实际上保温开始时培养基中活微生物数不是N0而是Np，得：,其中tp为升温阶段时间，可从100开始算起，可从经验值或通过热量恒算取得该数值。Km为这一温度段内的灭菌速率常数的平均值，即:,思考及练习题,1.请列出适用于培养基灭菌的方法，并比较各自的优缺点。2.有一发酵罐，内装有40m3的培养基，在121的温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基中含有 耐热菌的芽孢2107个，121 时的灭菌速度常数为0.0287s-1。试求当灭菌失败几率为0.001时 所需的灭菌 时间。3.请分析培养基分批灭菌过程和连续灭菌过程中的温度变化情况。4.在121下，枯草杆菌FS5239的比死亡速率为0.050s-1，梭状芽孢杆菌PA3679的比死亡速率为 0.030s-1，嗜热脂肪芽孢杆菌FSl518和FS617的比死亡速率分别为0.013s-1和0.048s-1，请列出 上述微生物在121热灭菌时的受热死亡容易程度顺序。5.影响培养基灭菌的因素有哪些?6.有一装量为28 m3的发酵罐，蛇管面积为30 m2，现需进行实罐灭菌。设培养基的初始温度为 25，用0.2 MPa（表压）的蒸汽经过蛇管间接加热至90，试求：加温时间及蒸汽用量；如若用10的冷却水冷却经灭菌后的培养基，将其从120冷至30，已知当发酵培养基 温度为80时，冷却水出口温度为30，试求冷却水用量及冷却时间。,