质粒DNA限制性酶切图谱分析.ppt

一、DNA的限制性酶切实验原理,实验三 质粒DNA限制性酶切图谱分析,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的片段端为，端为。,根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。,1.限制性内切酶的类型,一、DNA的限制性酶切实验原理,第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,1.限制性内切酶的类型,一、DNA的限制性酶切实验原理,第三类（型）限制性内切酶就是通常指的限制性内切酶.它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,1.限制性内切酶的类型,一、DNA的限制性酶切实验原理,粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：5 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT ATC 33 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli 用Eco表示，所以用斜体字。用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind,Hind，Hind等。,2.限制性核酸内切酶的命名法,一、DNA的限制性酶切实验原理,由 pUC18改造而来，大小为 3162bp。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。,二、琼脂糖凝胶电泳实验原理,琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。,二、琼脂糖凝胶电泳实验原理,（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。（2）电泳速度快。（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（4）样品易回收，常用于制备。,琼脂糖电泳的优点,配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。,琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围,常用的电泳缓冲液,4 保存备用.,常用的6X载样缓冲液,0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液,三 材料、设备及试剂,质粒：pUC118、pEGFP设备：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)，台式 高速离心机，电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、微波炉 试剂：琼脂糖、TAE电极缓冲液、Lamdar DNA EcoR I/Hind、EB、加样缓冲液,四、操作步骤,1、质粒DNA的限制性酶切反应（1）、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号,用微量移液枪分别加入DNA 5l，10缓冲液2l,BSA 2ul，EcoRI 1ul，ddH2O 10ul，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37水浴保温1小时,使酶切反应完全。（3）、每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。,2、琼脂糖凝胶电泳(1)称取0.25g琼脂糖，置25ml电泳缓冲液中，加热使琼脂糖溶解；(2)待溶液冷至60，加入2ul SYBR Green I。(3)在距离胶模底板0.5-1mm处放置电泳梳，将琼脂糖溶液倒入胶模中，厚度约3-5mm，注意避免产生气泡；(4)凝胶完全凝固后，移去梳子和挡板，将凝胶放入电泳槽。加入TAE缓冲液使恰好没过胶面约1mm；(5)将DNA样品与1/6体积加样缓冲液混合后，加入样品槽中；(6)接通电源，使样品槽在负极端，用80V的电压，至溴酚蓝到胶前沿时，停止电泳。(7)凝胶自动处理系统（UVP）观察和拍照，记录结果。样品：DNA5ul、6X点样液2 ul，电极缓冲液5ul pUC118、pEGFP、pUC118/EcoRI、pEGFP/EcoRI、细菌基因组DNA DNA Marker(2ul，6X点样液2 ul，电极缓冲液5ul),实验结果：分析酶切图谱,内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ug DNA对u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,五、注意事项限制性内切酶酶切,作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（1020U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。,五、注意事项限制性内切酶酶切,：,反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成种级别的离子强度：低盐（10mM NaCl)中盐（50mM NaCl）高盐（100mM NaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,五、注意事项限制性内切酶酶切,反应缓冲液：,大多数限制酶反应温度为，如EcoR,Hind,BamH,Pst等，也有如Bcl需在下进行反应，反应时间根据酶的单位与用量之比来定，原则是酶：=：小时即可，充分酶解。,五、注意事项限制性内切酶酶切,酶解温度与时间：,五、注意事项DNA凝胶电泳,1.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。2.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。3.电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应常更新电泳缓冲液。,4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5g的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定。当加样孔大时，样品上样量应相应加大，否则会造成条带浅甚至辩认不清；反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。5.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。,五、注意事项DNA凝胶电泳,内切酶失活DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子条件不适（试剂、温度）DNA酶切位点上的碱基被甲基化DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）DNA位点上存在其它修饰DNA不存在该酶识别顺序,标准底物检测酶活性将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA检查反应系统是否最佳换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增将DNA底物与DAN混匀进行切割验证换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证,六、限制性内切酶酶切常见问题分析,问题一：DNA完全没有被内切酶切割,原因,对策,内切酶活性下降内切酶稀释不正确DNA不纯，反应条件不佳内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰部分DNA溶液粘在管壁上内切酶溶液粘度大，取样不准酶切后DNA粘末端退火由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性过度稀释使酶活性降低反应条件不适识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序,用5-10倍量过量消化用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶同上同上反应前离心数秒将内切酶稀释，增大取样体积电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏使用最佳反应体系加大酶量5-10倍,问题二：DNA切割不完全,原因,对策,六、限制性内切酶酶切常见问题分析,内切酶星状活性其它内切酶污染底物中含其它DNA杂质,检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量用DNA作底物检查酶切结果电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段,问题三：DNA片段数目多于理论值,原因,对策,六、限制性内切酶酶切常见问题分析,DNA定量错误（如RNA含量较高）在酶切反应液中形成非特异的沉淀,用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次,问题四：酶切后没有观察到DNA片段的存在,原因,对策,五、限制性内切酶酶切常见问题分析,保存温度不合适以稀释形式保存贮藏缓冲液不适当低蛋白浓度,内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20低温保存稀释酶液不宜长期存放，应一次使用使用厂家推荐的贮藏缓冲液内切酶与500ug/ml的BSA一起保存,问题五：内切酶保存期内快速失活,原因,对策,五、限制性内切酶酶切常见问题分析,DNA上结合有蛋白质内切酶中含有DNA外切酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一,原因,对策,五、限制性内切酶酶切常见问题分析,含磷酸盐的浓度高内切酶失活不全或含有ATP酶平末端连接外切酶污染连接缓冲液不合适,透析，乙醇沉淀去除磷酸盐延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA加大T4 DNA Ligase用量减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA重新配制连接缓冲液,七、DNA电泳常见问题分析,问题七：酶切后的DNA片段连接效率低,原因,对策,DNA降解电泳缓冲液陈旧所用电泳条件不合适DNA上样量过多DNA样含盐过高有蛋白污染DNA变性,避免核酸酶污染电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力减少凝胶中DNA上样量电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐电泳前酚抽提去除蛋白电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA,七、DNA电泳常见问题分析,问题一：DNA带模糊,原因,对策,对于/Hind III片段cos位点复性电泳条件不合适DNA变性,电泳前于65加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热,问题二：不规则DNA带迁移,对策,原因,七、DNA电泳常见问题分析,DNA的上样量不够DNA降解DNA走出凝胶对于EB染色的DNA，所用光源不合适,增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低避免DNA的核酸酶污染缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度应用短波长（254nm）的紫外光源,问题三：带弱或无DNA带,对策,原因,七、DNA电泳常见问题分析,小DNA带走出凝胶分子大小相近的DNA带不易分辨DNA 变性DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA在脉冲凝胶电泳上分析,问题四：DNA带缺失,对策,原因,七、DNA电泳常见问题分析,八、问题与讨论,1.在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？2.反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10？3.在酶切缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）的目的与机理是什么？,Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker,