生物化学-蛋白质的一级结构.ppt
第三节 蛋白质的一级结构,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。,一、肽和肽键的结构,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,*两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,*由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln各肽链共价主键相同，侧链不同,肽键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。,肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。,四肽的结构,二、肽的物理和化学性质,短肽晶体的熔点很高，说明短肽的晶体是离子晶格，在水溶液中以偶极离子存在。肽的酸碱性质决定于游离末端的氨基和羧基以及侧链基团上的可解离基团。根据Handerson-Hasselbalch方程：pH=pK+lg质子受体/质子供体当溶液pH大于解离侧链的pK值，占优势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液的pH小于解离侧链的pK值，占优势的离子形式是该侧链的共轭酸,净电荷为零时的溶液pH就是该肽的等电点 pI=(4.5+7.8)/2=6.15肽的氨基末端的氨基酸残基可与茚三酮发生定量反应。双缩脲反应：肽和蛋白质特有短肽的旋光度约等于各氨基酸的旋光度的总和。长肽或蛋白质的旋光度不等于各氨基酸的简单加和,三、天然存在的活性肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽)由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine,缩写为 Orn）。,四、蛋白质的一级结构测定,蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目.多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,1，样品必需纯（97%以上）；2，知道蛋白质的分子量；3，知道蛋白质由几个亚基组成；4，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,测定蛋白质的一级结构的要求,测定步骤,(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。根据蛋白质末端残基的摩尔数和蛋白质的分子量可以确定蛋白质分子中的多肽链数目。（2）多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。（3）测定多肽链的氨基酸组成完全水解后测定氨基酸组成，计算出氨基酸成分的分子比。,蛋白质一级结构的测定步骤,测定步骤,（4）分析多肽链N端和C端残基。建立两个重要的氨基酸顺序参考点（5）断裂多肽链内的二硫键。（6）多肽链断裂成肽段。用两种或几种不同的断裂方法将多肽链样品降解成几套肽段，并将这些肽段分离开来。（7）测定各个肽段的氨基酸次序Edman降解法、酶解法、色质联用,蛋白质一级结构的测定步骤,测定步骤,（8）确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或几套肽段的氨基酸顺序彼此间又交错重叠，可拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。（9）确定原多肽链中的二硫键位置。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定步骤,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端基氨基酸测定,五、N末端和C末端氨基酸残基的测定,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端基氨基酸测定,二硝基氟苯（DNFB）法,N末端分析方法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。且水解后的产物不需要提取。,末端基氨基酸测定,丹磺酰氯法（DNS）,N末端分析方法,氨基酸末端氨基也能与PITC作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质。在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC-氨基酸发生环化，生成PTH-衍生物掉下来。除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的溶液中的N末端残基的PTH-氨基酸，提取后可鉴定此法还可用来测定氨基酸顺序,末端基氨基酸测定,苯异硫氰酸酯PITC法,N末端分析方法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端基氨基酸测定,氨肽酶法,N末端分析方法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,末端基氨基酸测定,肼解法,C末端分析方法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,末端基氨基酸测定,羧肽酶法,C末端分析方法,多肽链C-端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的氨基醇。肽链完全水解后，代表原来C末端氨基酸的氨基醇，可以用层析法加以鉴别。,末端基氨基酸测定,还原法,C末端分析方法,六、二硫键的断裂和多肽链的分离,几条多肽链通过非共价键连接成寡聚蛋白质时：可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，能使寡聚蛋白质分子中的亚基（多肽链）拆开。,蛋白质一级结构的测定,若多肽链之间由二硫键交联，或有链内二硫键：用过量的巯基乙醇在pH8-9、室温下放置数小时，使二硫键定量还原为巯基，然后在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在时，用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,六、二硫键的断裂和多肽链的分离,1,作用：这些反应可用于巯基的保护。,巯基（-SH）的保护,七、氨基酸组成的测定,酸水解：用6mol/L盐酸于110在真空的或者充氮的安培瓶内进行水解，时间10-24小时，水解后去除HCl。酸水解后的氨基酸均不消旋。色氨酸全部破坏，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸部分破坏。天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺及被水解。同时辅以碱水解。,蛋白质一级结构的测定,七、氨基酸组成的测定,碱水解：用5mol/L氢氧化钠于110在真空的或者充氮的安培瓶内进行水解，时间20小时。可以测定色氨酸。其他氨基酸全部破坏。,蛋白质一级结构的测定,表120,酶解法:胰蛋白酶：只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽链，专一性强。若待测多肽链中赖氨酸残基和精氨酸残基的数量较多，为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以用化学修饰将侧链基团保护起来：Lys化学修饰：马来酸酐保护侧链上的-NH2 Arg化学修饰：用1，2-环己二酮修饰胍基若想增加多肽链中的蛋白酶断裂位点：用氮丙啶处理样品，使Cys残基侧链被修饰成类似Lys的侧链。,多肽链的选择性降解,八、多肽链的部分断裂和肽段的分离,糜蛋白酶：断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基形成的肽链。断裂临近的基团是碱性的，裂解能力强。嗜热菌蛋白酶：含金属锌和钙的蛋白酶，专一性差胃蛋白酶：要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，最适合的pH值8-9。金黄色葡萄球菌蛋白酶：磷酸缓冲液中在Glu和Asp残基的羧基侧链断裂肽链。梭状芽孢杆菌蛋白酶：Arg羧基形成的肽链,多肽链的选择性降解,八、多肽链的部分断裂和肽段的分离,化学法：(Cyanogen bromide)溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,八、多肽链的部分断裂和肽段的分离,用羟胺断裂：能专一地断裂Asn-Gly之间的肽链，Asn-Leu及 Asn-Ala键也能部分断裂。肽段的分离提纯：凝胶过滤、凝胶电泳、离子交换柱层析、高效液相色谱、薄层层析等分离。,多肽链的选择性降解,八、多肽链的部分断裂和肽段的分离,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman氨基酸顺序分析法,九、肽段的氨基酸顺序测定,用Edman降解法，一次能连续测出60-70个残基的肽段顺序,外切酶 氨肽酶、羧肽酶。从肽链的N端和C端逐个向里切。质谱法根据核苷酸序列推定,九、肽段的氨基酸顺序测定,十、肽段在多肽链中次序的决定,利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,十一、二硫键位置确定,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。胃蛋白酶酶解后对角电泳分离,蛋白质一级结构的测定,对角电泳：把水解后的混合肽段点到滤纸中央，进行第一向电泳。过甲酸蒸汽薰蒸，使二硫键断裂，变成含磺酸的肽滤纸旋转90进行第二次电泳。含半胱胺磺酸的肽段偏离对角线取下进行氨基酸顺序分析，比较后判断二硫键位置,十二、蛋白质的一级结构与生物功能,（一）同源蛋白质的种属差异与生物进化同源蛋白质的氨基酸顺序中有相似性，在生物进化上有重要意义（进化树）（二）一级结构的局部断裂与蛋白质的激活1.血液凝固的生物化学机理 凝血酶原凝血酶纤维蛋白原纤维肽A、B纤维蛋白血凝块纤维蛋白溶酶原纤维蛋白溶酶,十三、多肽与蛋白质的人工合成,（一）多肽的人工合成控制合成或聚合在控制合成中，需要保护不参加接肽反应的基团每连接一个氨基酸残基都要经过几个步骤，要求高产率。保护基：接肽时保护，接肽后易除去,常用保护基：氨基保护基：苄氧甲酰基、三苯甲基、叔丁氧甲酰基、对甲苯磺酰基。羧基保护基：盐（钾、钠、三乙胺盐）；酯（甲、乙酯、苄酯、叔丁酯）Cys的-SH：苄基、对甲氧苄基,羧基活化：使碳原子亲电性加强 酰氯法：用PCl5处理氨基酸，生成酰氯 叠氮法：不消旋,活化酯法：氨基酸对硝基苯酯与另一氨基酸 缩合 混合酸酐法：,（二）胰岛素的人工合成,1965年我国科学家完成了牛胰岛素的全合成分别合成了A链21肽和B链30肽，再将两条链经还原、氧化连接成牛胰岛素,（三）固相多肽合成,肽链的延长在不溶性聚苯乙烯树脂小球上进行。,合成到最后一步时，把树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥的HBr，使多肽与树脂脱离。固相多肽合成仪,
