1.2基因工程的原理和技术.ppt
什么叫基因工程？,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,核心构建重组DNA分子,科技探索之路,基因工程诞生的理论基础：,DNA是生物遗传物质的发现、DNA双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定,基因工程的技术保障：,？,DNA重组技术的基本工具,准确切割DNA的工具（“基因的剪刀”）DNA片段的连接工具（“基因的针线”）基因转移工具（“运载体”）,基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：,重播,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,一、“基因的剪刀”限制性核酸内切酶,二、“基因的针线”DNA连接酶,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,作为运载体的必要条件,能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。对受体细胞无害,三、基因的运载工具运载体,常用的运载体：1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒,质粒是细胞染色体外能够自主复制的双链环状DNA分子。存在于细菌、酵母菌和放线菌等生物中。,1.水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是A促使目的基因导入宿主细胞中 B使目的基因容易被检测出来C促使目的基因在宿主细胞中复制 D使目的基因容易成功表达,B,2现有一长度为3000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图l。用酶B单独酶切，结果如图2。用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。下列相关叙述正确的是,B,A酶H有2个识别位点和切割位点B酶B和酶H同时切割时，有3个识别位点和切割位点C酶B和酶H同时切割时，能产生完全相同的酶切片段D酶B和酶H有相同的识别和切割位点,3下列关于生物工程中常用的几种酶的叙述中，错误的是 A一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，能用于提取目的基因BDNA连接酶可把目的基因与运载体黏性末端的碱基黏合，能形成重组DNAC纤维素酶、果胶酶可分解细胞壁，能用于原生质体的制备和培养D胰蛋白酶能使动物组织分散成单个细胞，能用于动物细胞培养,B,练习,1、下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，判断正误,Aa通常存在于细菌体内，目前尚未发现真核生物体内有类似的结构Bb识别特定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开Cc连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对,2、人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接,B,第二节 基因工程的原理和技术,阅读课本P5-7页回答以下问题:,1.简述基因工程的基本原理,2.概述基因工程操作的基本步骤,获得目的基因,形成重组DNA分子,将重组DNA分子导入受体细胞,筛选含有目的基因的受体细胞,目的基因的表达,一、获取目的基因,1、获取目的基因的方法,（1）已知目的基因序列时，可以用人工合成的方法,反转录法化学合成法,目的基因的提取方法：人工合成,A.反转录法：,目的基因的mRNA,单链DNA,双链DNA(即目的基因),反转录,合成,已知目的基因的序列时,B.可以从无到有合成,2、利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应(PCR)，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。,循环,目的基因的扩增呈指数形式扩增（2n）,PCR技术,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_。前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,模板(已知基因的核苷酸序列),四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性50-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在DNA聚合酶的作用下，从引物延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA双链,基因组文库的构建 将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库。,3、如果未知基因的序列:建立基因文库,基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中通过克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,比较基因、目的基因、基因文库的区别,基因：有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状 的遗传物质的基本结构和功能单位,目的基因：是基因工程操作中需要的外源基因,二、形成重组DNA分子核心步骤,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口两个黏性末端,质粒,1.图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,能不能使用SmaI切割?为什么?,思考,2.若将图中的目的基因插入载体,需要用哪一种限制酶同时切割载体和目的基因?,3.与只使用EcoRI相比较,使用BamHI和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？,三、将重组DNA分子导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,1）将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,获得重组质粒,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术（最多、最有效）,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。,四、筛选含有目的基因的受体细胞,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少,怎样筛选？,目的基因插入四环素抗性基因中,将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上,然后将菌落平移按到含四环素的培养基上培养,从分子水平进行筛选,DNA分子杂交,含有目的基因,不含目的基因,五、目的基因的表达,目的基因的表达是基因工程完成的标志,插入哪一条染色体、插入某一染色体的位置都是随机的，这样可能破坏正常基因的结构和功能，使受体细胞不能完成某项生命活动甚至死亡。,目的基因插入动植物细胞基因组的随机性问题,糖蛋白是蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网上加工完成的。内质网存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这种细胞器，因此，由大肠杆菌中生产糖蛋白是不可能的。,基因工程中生产糖蛋白，为什么不选大肠杆菌而选酵母菌为受体细胞？,这就可以解释基因工程中为何用大肠杆菌生产人胰岛素原、而用酵母菌生产干扰素。,用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是 A常用相同的限制性内切酶处理的基因 和质粒 BDNA连接酶和 RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶 C可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒 D导入大肠杆菌的目的基因不一定能 成功表达,B,下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A B CD,D,基因工程又叫基因拼接技术。(1)在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：以目的基因转录的 为模板，成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成。(2)基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、。(3)假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。连接产物至少有 种环状DNA分子，它们分别 是。,信使RNA,逆转录,双链DNA(目的基因),动植物细胞,3,质粒自连的、目的基因片段自连的、质粒与目的基因片段相连的环状DNA分子,继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。（2进行基因转移是，通常要将外源基因转入_中，原因是_。（3）通常采用_ 技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的_细胞中特异表达。(5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠细胞的_ _转入_细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为_,显微注射法,受精卵（早期胚胎）,受精卵（或早期胚胎）具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达,DNA分子杂交,膀胱上皮,细胞核,去核的卵,核移植（或克隆）,（2009高考-X 江苏）人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。,（3）已知限制酶E识别序列为CCGG,若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域（见上图），那么正常人的会被切成_个片段，而患者的则被切割成长度为_对碱基和_对碱基的两种片段。（4）如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460碱基对的四种片段，那么该人的基因型是_（以P+表示正常基因，Pn表示异常基因）。,（10江苏卷）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈l、圈2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：,（1）一个图1所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有 个游离的磷酸基团。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna 切割，原因是。（4）与只使用EcoR I相比较，使用BamH 和Hind 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止。,（1）0、2 解析：质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图1可以看出，质粒上只含有一个Sma的切点，因此被改酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团。（3）Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 解析：质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图2可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有Sma酶切位点，都可以被Sma破坏，故不能使用该酶剪切含有目的基因的DNA（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 解析：只使用EcoR I，则质粒和目的基因两端的粘性末端相同，用连接酶连接时，会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamH 和Hind 剪切时，质粒和目的基因两端的粘性末端不同，用DNA连接酶连接时，不会产生自身连接产物。,
