微生物的遗传变异与菌种选育.ppt
第六章 微生物的遗传变异与菌种选育,第一节 微生物遗传变异的物质基础第二节 微生物的基因突变第三节 微生物的基因重组质 第四节 微生物的菌种选育 第五节 微生物菌种的保藏和复壮,第一节 微生物遗传变异的物质基础,种质连续理论：18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。基因学说：二十世纪初发现了染色体并提出基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合，可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字，而核酸的组成却简单得多，一般仅由4种不同的核苷酸组成，它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸，因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因，起活性成分是蛋白质。DNA是遗传变异的物质基础的证明：1944年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）,1928年，Griffith进行了以下几组实验：（1）动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活对小鼠注射活S菌小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌 小鼠死亡 抽取心血分离活的S菌,一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验,（一）肺炎双球菌转化实验（transformation）：F.Griffith，研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜,（2）细菌培养实验热死S菌不生长活R 菌长出R菌热死S菌+活R 菌长出大量R菌和10-6S菌,（3）S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状,加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以 外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年、和M。McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，在离体条件下进行了转化试验：,只有S型细菌的DNA才能将S.Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,（二）噬菌体的感染实验,A.D.Hershey和M.Chase，1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。,（三）烟草花叶病毒的拆开与重组实验,为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：（1）RNA（TMV）蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）蛋白质（TMV）用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2）表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。,二、遗传物质在细胞中的存在方式 1.细胞水平 2.亚细胞核水平 3.分子水平,一、基因突变,基因突变（gene mutation）简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-810-9范围内。,第二节 微生物的基因突变,突变株的表型成因检出方法营养缺陷型 因突变而丧失合成一补充培养基（auxotroph）种或几种生长因子的 能力不能在基本培养 基上生长突变株抗性突变型 因突变而产生了对某药物培养基（resistant mutant）种化学药物或致死 物理因子的抗性条件致死型 突变后在某种条件下 培养条件改变（conditional 可正常生长、繁殖并lethal mutant）实现其表型，而在另 一条件下却无法生长 繁殖的突变型,一、基因突变的类型,突变株的表型成因 检出方法形态突变型 因突变而产生的个体 形态Morphologycal 或菌落形态的非选择（常用颜色变化）mutant 性变异抗原突变型 因突变而引起的抗原 借助于抗原antigenic 结构发生改变 抗体反应 mutant其它突变型：毒力、糖发酵能力、代谢产物等,二、突变的特点1.不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。（变量试验、涂布试验、平板影印培养试验）2.自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。3.稀有性：突变率低且稳定。4.独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。5.可诱发性：诱变剂可提高突变率。6.稳定性：变异性状稳定可遗传。7.可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），相反的过程则称为回复突变或回变（back mutation或 reverse mutation）。,.诱发突变的机制,诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。,三、基因突变的机制,碱基置换（substitution）,定义：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（point mutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类：转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；颠换（transversion），即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。,直接引起置换的诱变剂,一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起GCA：T外，其余都是可使GC A：T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。,移码突变,移码突变（frame-shift mutation）指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame shift mutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。丫啶类染料，如丫啶黄、丫啶橙和-氨基丫啶等，都是移码突变的有效诱变剂。,丫啶类化合物的诱变机制,至今还不很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。,染色体畸变（chromosomal aberration）,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，包括以下两个方面：染色体结构上的缺失（deletion）、重复（duplication）、易位（translocation）和倒位（inversion）染色体数目的变化。,染色体结构上的变化,染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；又如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。倒位是指断裂下来的DNA片段旋转180后，重新插入到原来染色体的位置上；易位则指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。,紫外线（U.V.，ultraviolet ray）对DNA的损伤,嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物，其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。,.自身突变的机制,背景辐射和环境中多因素低剂量的诱变效应微生物自身代谢产物的诱变效应互变异构效应环状突出效应,第三节 微生物的基因重组,基因组：细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的DNA序列。,一、原核生物的基因重组,紧密缠绕的环状双链DNA分子遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子结构结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝基因组的重复序列少而短,二、真核生物的基因重组,DNA与组蛋白构成染色体有间隔子或内含子序列没有明显的操纵子结构含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复）遗传丰余：较高同源性的DNA重复序列,第四节 微生物的菌种选育,在微生物工业应用中，微生物菌种工作主要包括以下四方面：菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这是选种工作的任务。菌种培育：改良已有菌种的生产性能，使产品的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是育种工作的任务。菌种的保藏：一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。退化菌种的复壮：如果发现菌种的生产性能下降，就要设法使它恢复，这便是菌种复壮工作的任务。,一、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤,（一）诱变育种的一般步骤和方法出发菌株同步培养 使菌细胞处于相同或接近的生理状态单细胞（或单孢子）菌悬液的制备 单细胞或单孢子的意义 酵母或霉菌孢子106/ml、细菌108/ml 诱变剂的选择及其剂量的确定 以致死率为9099 为宜诱变处理 物理诱变剂 化学诱变剂,确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法重复筛选 摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,二、微生物的诱变育种,二、微生物的诱变育种,（二）变异菌株的初步筛选,纸片培养显色法,透明圈法,琼脂块培养法,1 筛选用培养基 基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以-表示；在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用+表示；在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用A、B等来表示。,（三）营养缺陷型突变体的筛选及其应用,二、微生物的诱变育种,2营养缺陷型菌株筛选的一般方法（1）诱变剂处理（2）淘汰野生型菌株 抗生素法 菌丝过滤法（3）检出营养缺陷型（4）鉴定营养缺陷型,检出营养缺陷型,鉴定营养缺陷型,含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。营养缺陷型营养类别的鉴定。缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。,原生质体融合育种,细胞（A+B）细胞（AB+）脱壁处理 脱壁处理 原生质体（A+B）原生质体（AB+）混合 加融合剂 原生质体融合 涂平板（原生质体再生）形成菌落 检出重组子菌落（A+B+）,转基因工程菌株的构建,1提取目的基因 用密度梯度离心方法分别从供体细胞中提取所需要的DNA即目的基因和作为载体的细菌质粒或噬菌体核酸，目的基因也可通过化学方法人工合成。2处理目的基因 根据基因工程的“设计蓝图”的要求，在从供体细胞中提取出的目的基因中加入专一性很强的限制性核酸内切酶进行处理，从而获得带有特定基因并暴露出粘性末端的DNA单链部分。必要时这种粘性末端也可用人工方法合成。对作为载体的细菌质粒或噬菌体DNA可采用与处理目的基因同一种类的限制性核酸内切酶进行处理，使其形成并暴露出与目的基因相应的粘性末端。3体外重组 将上述分别处理过的目的基因和细菌质粒DNA片段（或噬菌体核酸）放在试管中，在较低温度（56）下混合“退火”。由于这两种DNA是用同一种限制性核酸内切酶进行处理，具有相同的粘性末端，因此相互之间能够形成氢键，这就是所谓“退火”。而相邻的核苷酸，在DNA连接酶的作用下也能形成磷酸二酯键，这样就完成了目的基因与质粒DNA（或噬菌体DNA）的重组，得到的是一个完整的具有复制能力的环状DNA重组体，即“杂种质粒”（或杂种噬菌体）。4载体传递 即通过载体将供体生物中的遗传基因导入到受体细胞内。载体必须具有自我复制的能力，一般可利用质粒的转化作用或噬菌体的转导作用，将供体基因带入受体细胞内。5复制、表达 在理想情况下，进入受体细胞内的杂种质粒（或杂种噬菌体），可通过自我复制到扩增，并使受体细胞表达出作为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为“工程菌”。6筛选、繁殖 当前，由于分离纯净的基因功能单位还很困难，所以通过重组后的“杂种质粒”的性状是否都符合原定的“设计蓝图”，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等，都还需要经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个体，然后才可加以繁殖和利用。,第五节 微生物菌种的保藏和复壮一、菌种的保藏,1低温保藏法 斜面菌种直接放入04冰箱中保藏，保存时间不宜过长，一般为 36个月；用-20以下的超低温冰箱或干冰、液氮（-195）冻结保藏，长达数年。2干燥保藏法 主要是指把菌种接种到适当载体上，在干燥条件下进行保藏。这种保藏方法主要适合于细菌的芽胞和霉菌的孢子。细菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麸皮管保藏。3隔绝空气保藏法 用固体石蜡密封试管口以隔绝空气，4真空冷冻干燥保藏法 其基本过程是：培养菌种加菌种保护剂（一般食品工业用菌种多用牛乳作保护剂）分装、预冻真空冻干真空封口。5寄主保藏法 用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。,第五节 微生物菌种的保藏和复壮二、菌种的退化与复壮,（一）常见的菌种退化现象（二）菌种退化的原因 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。（三）防止菌种退化的措施 1控制传代次数 2创造良好的培养条件 3利用不同类型的细胞进行移种传代 4采用有效的菌种保藏方法（四）退化菌种的复壮,
