微生物发酵工程案例教学.ppt
Engineered Saccharomyces cerevisiae that produces 1,3-propanediol from D-glucose工程化啤酒酵母细胞利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇 文献查找：张帆 文献翻译：曾熙、朱悦、张帆 PPT整理及展示：张艳丽（组长）,二、背景,三、实验方法,一、摘要,四、实验结果,摘要,在发酵产业中啤酒酵母是一种安全的微生物。1,3-丙二醇是一种广泛用于聚合物生产的重要化学原料，但是由于化学合成成本昂贵，它的实用性受到限制。本研究的目的就是利用工程化啤酒酵母低成本生产1,3-丙二醇。啤酒酵母利用D-葡萄糖作为原料，能够生产丙三醇，而不是1.3-丙二醇。在本研究中，我们克隆了两个基因yqhD和dahB，这两个基因可以使丙三醇转化成1,3-丙二醇，把这两个基因通过农杆菌转化实验整合到啤酒酵母的W303-1A染色体上。这个工程化的啤酒酵母通过功能性yqhD和dhaB基因来实现D-葡萄糖到1,3-丙二醇的生产。据了解，该研究在1,3-丙二醇生产产业中是一种安全的、低成本的方法。,背景,背景,使用与成本的矛盾,降低成本,化学合成发酵,背景,克雷伯肺炎菌：在克雷伯肺炎菌中，参与1,3-丙二醇的生物合成的基因是dhaB和dhaT。DhaB是一种依赖维生素B12的脱水酶，它转化丙三醇到3-羟基丙醛，而DhaT是一种依赖NADH的氧化还原酶，它可以转化3-羟基丙醛到1,3-丙二醇。大肠杆菌：大肠杆菌能利用D-葡萄糖生产丙三醇，可以通过把dhaB和dhaT基因整合到大肠杆菌来生产1,3-丙二醇，但是DhaT活性过低，导致收率低。yqhD基因的发现解决了这一问题。,背景,克雷伯肺炎菌的生产原料是丙三醇，价格昂贵。大肠杆菌产生内毒素，可能引起疾病。啤酒酵母已经用于发酵产业好多年了，主要是由于它使用D-葡萄糖这种低成本原料作为碳源和能源。野生型啤酒酵母只产生丙三醇，但没有产生1,3-丙二醇的能力。,背景,实验方法,一、材料：PCR试剂、限制酶、小牛碱性磷酸酶、凝胶提取盒、尼龙膜等,二、培养基和生长条件,实验方法,四种培养基：发酵条件：有氧环境、摇床250rev/min30。,LB培养基,YPD培养基,B培养基,CM培养基,实验方法,用于这项研究的菌株、质粒和引物：,实验方法,DNA片段的PCR扩增分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒土壤农杆菌介导的转化啤酒酵母染色体上的yqhD和dhaB基因的PCR与印迹杂交分析气相色谱法测定1,3-丙二醇,实验方法,分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒；构建pZR3质粒；构建包含yqhD和dhaB基因的质粒pZR4,实验方法,土壤农杆菌介导的转化在本研究通过农杆菌介导的转化方法将yqhD基因和dhaB基因整合到啤酒酵母的染色体上。第一步，质粒pZR4通过电穿孔转染到农杆菌LBA4404，形成LBA4404-ZR4.农杆菌LBA4404-ZR4在含有博来霉素的B培养基上培养过夜，收菌，在B培养基上重悬培养（含或不含100umol/l乙酰丁香酮），生长到1x1011cell ml-1，再孵化培养6h。与此同时，啤酒酵母W303-1在摇床30下培养过夜，稀释20倍到新鲜的YPD培养基上，培养6h。细胞通过离心收集，用不含乙酰丁香酮的B培养基清洗，然后重悬，接种到相同培养基上，最后生长到1x109cells ml-1.随后，50ul啤酒酵母W303-1A和50ul农杆菌LBA4404-ZR4做好前期混合准备，储存在高压蒸汽过的胶膜纸上（直径25mm），上面有固体CM培养基，添加乙酰丁香酮，孵育在28，72h。然后，胶膜纸被移到固体YPD培养基（含150ug/ml博来霉素），孵育30，3-4days。为了预防供体农杆菌过生长，在培养基中添加了200ug/ml头孢噻肟。啤酒酵母指定的W303-1A-ZR，在30，YEPD（含150ug/ml博来霉素）培养基中进一步纯化。,实验方法,啤酒酵母染色体上的yqhD和dhaB基因的PCR与印迹杂交分析：,实验方法,酶试验细胞粗提物通过细胞糊状物声波破碎和离心获得，细胞粗提物含各种酶。丙三醇脱水酶活性通过使用3-甲基-2-苯并噻唑方法评估。由于3-羟基丙醛的不稳定性，1,3-丙二醇氧化还原同工酶活性通过逆反应（1,3-丙二醇转化到3-羟基丙醛）来断定。1,3-丙二醇同工酶的浓度通过Gerlind方法断定。所有酶试验在30度中进行。一个酶活单位定义成：30度下，催化1umol底物到产物所需的酶数量。特殊的酶活力显示的单位/mg蛋白。所有酶试验重复两次，报道的数值是两次实验的均值。细胞提取物中的蛋白浓度是通过Bradford法断定的。,实验方法,气相色谱法测定1,3-丙二醇：1,3-丙二醇和丙三醇是通过气相色谱法测定的。本研究使用的圆柱体是2m X 5mm不锈钢圆柱体，包装的色谱载体是101.氮气，流速40 ml min-1.检测温度定在220，圆柱体温度定在210。,实验结果,工程化啤酒酵母关键质粒的构建基因yqhD和dhaB整合到啤酒酵母的染色体工程化啤酒酵母W303-1A-ZR能够利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇,实验结果,工程化啤酒酵母 关键质粒的构建,实验结果,实验结果,基因yqhD和dhaB整合到啤酒酵母的染色体：,实验结果,实验结果,工程化啤酒酵母W303-1A-ZR能够利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇,实验结果,Thank you!,
