应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用.ppt

应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用,内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心,制作人：王瑞刚,实验原理实验试剂实验步骤,实验原理,氨基酸分子上的氨基转移到-酮酸分子上的反应称为转氨基作用.转氨基作用是氨基酸的重要反应之一，由转氨酶催化.经转氨基后,原 来的氨基酸变成了酮酸，原来的酮酸变成相应的氨基酸。纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品 达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细 现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显 色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物质在纸层 析谱上的位置常用比移值Rf来表示。,Rf=,纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽 提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在 两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。由于滤纸纤维可吸收2025%的水分；且其中67%以氢键形式 与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水 相作固定相，展开的溶剂作流动相。纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基 酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双 向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。,实验试剂,10.01M pH7.4 磷酸缓冲液：0.2 M Na2HPO4溶液81ml与0.2M NaH2PO4 溶液19ml混匀，加蒸馏水稀释 20倍。20.1M L-丙氨酸：称取0.891g L-丙氨酸（如DL丙氨酸用量加倍），用 少量0.01 M pH7.4 磷酸缓冲液溶解，以NaOH溶液 小心调pH至7.4，再用磷酸缓冲液定容到100ml。30.1M L-谷氨酸：称取1.47 g谷氨酸如上法配成100 ml溶液。40.1M L-酮戊二酸：称取1.46 g-酮戊二酸如上法配成100 ml溶 液。5层析溶剂：用水饱和的苯酚。用新蒸馏的苯酚2份，加蒸馏水1份(V/V)，放入分液漏斗中剧烈摇动后，在暗处静置若干时 间（7-10小时），待分层后，取下层清液备用。贮于棕色 瓶中暗处保存。60.1%（W/V）茚三酮,实验步骤,1肉糜制备：称取新鲜猪肝5克在低温下剪碎，用研钵研磨 成糊状备用。2酶促反应 按表次序在2支试管中加入试剂。,对照管当肉糜加入后立即煮沸l0min，而后放人37 水浴中与测定管同时保温，测定管加入肌肉糜后放人37 水浴中保温lh，然后于沸水浴中加热10min终止反应。冷 却后将二管分别静置以备层析用。3层析：取直径10-llcm圆形层析滤纸（已打孔）一张，通过圆心作一直径为2cm的圆，在圆周上分别取4等距点 分别作测定管和对照管溶液及标准丙氨酸、谷氨酸的点 样位置，点样时，将蘸水笔（使用前应放在酒精灯上烧 红，冷却，对应溶液只能用对应的笔点样）轻轻靠到滤 纸上(不能损伤滤纸)，使斑点直径为2-3 mm(不能超过 5mm)。为了有足够量的样品点在滤纸上，每种样品应 重复点3-4次，每次点样后待自然风干，再点下一次。,另取一滤纸小条将其下端剪成刷状，卷成“灯芯”插人中心 小孔处，使“灯芯”不突出纸面(少许突出纸面亦可)。然后将 该层析圆滤纸平放在盛有水饱和酚的康维皿上，纸芯下端 须状部分浸人溶液中，再在层析滤纸上罩一个大小合适的 表面皿，溶剂沿纸芯上升到滤纸，再向四周扩散，待溶剂 前沿到达距康维皿边缘0.5-lcm处时(约lh左右)，取出层析 滤纸，去掉纸芯，记下溶剂前沿，在电炉子上烘干以除去 酚溶剂。将已烘干的滤纸平放于表面皿上，用喷雾器向滤纸均 匀喷洒0.1%茚三酮溶液，放在电炉子上烘干即可看到好几 个紫红色斑点，比较各色斑点的位置及色泽深浅，并计算Rf值，分析实验结果。,