实验二固蓝盐比色法测定还原型抗坏血酸.ppt
固蓝盐比色法测定还原型抗坏血酸,（）目的要求 学习固蓝盐比色法测定食品中还原型抗坏血酸含量测定的原理及其检测方法。（二）实验原理VC是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C属于水溶性维生素VC广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会排出体外。,维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。,根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用的测定方法有：（1）2，6-二氯靛酚法（还原型VC）（2）固蓝盐比色法测定还原型抗坏血酸（3）2，4-二硝基苯肼法（总VC）（4）碘酸法（5）碘量法（6）荧光分光光度法,根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。VC通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷酸醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好。在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰肼-2-羟基丁酰内酯衍生物。可在其最大吸收波长（420nm）处测定吸光度，与标准系列比较定量。,（三）仪器与试剂 1试剂（1）2 molL乙酸溶液 吸取 11.6 mL冰醋酸，加水稀释至 100 mL。（2）0.5molL乙酸溶液吸取29mL冰醋酸，加水稀释至100 mL。（3）0.25molL乙二胺四乙酸二钠溶液称取 9.3g乙二胺四乙酸二钠（C10H14 N2O8 Na22H2O）加水并加热使之溶解，冷却并稀释至100 mL。（4）蛋白质沉淀剂 乙酸锌溶液称取 22.0 g乙酸锌Zn（CH3COO）22H2O，加 3mL冰醋酸溶于水并稀释至100 mL。亚铁氰化钾溶液称取 10.6 g亚铁氰化钾K4Fe（CN）6 3H2O，加水溶解至 100 mL。（5）显色剂固蓝盐 B（Fast Blue Salt B）溶液准确称取 0.2 g固蓝盐 B，加水于100mL棕色容量瓶中定容。该溶液在室温下贮存可稳定3d以上。（6）抗坏血酸标准储备溶液精密称取02000 g抗坏血酸，加 20mL 2 molL乙酸溶液，溶解后移入 100 mL棕色容量瓶中，用水定容并混匀。此溶液相当于 2.0 mgmL抗坏血酸（10下冰箱内贮存可稳定2d）。（7）抗坏血酸标准使用溶液用移液管精密吸取 5.0 mL抗坏血酸标准储备溶液于100 mL棕色容量瓶内。加 5 mL 2molL乙酸溶液并用水定容。此溶液相当于 100 gmL抗坏血酸（临用时配制）。,2仪器可见光分光光度计；捣碎机；离心机。（四）实验步骤 1样品溶液的制备（1）非蛋白性食品 液体试样抗坏血酸含量在 0.2gL以下的试样，混匀后可直接取样测定；抗坏血酸含量 0.2 gL以上的试样，用水适当稀释后测定。水溶性固体试样准确称取 1.05.0 g，精确至 0.001 g，加 5 mL 2 molL乙酸溶液研磨溶解后，移入100mL棕色容量瓶内，加水定容。蔬菜、水果样品称取鲜样可食部分20.0050.00 g，加等量的2molL乙酸溶液用捣碎机捣成匀浆。称取 10.020.0 g匀浆于 100mL棕色容量瓶内，加 5 mL 2 molL乙酸溶液，用水定容，过滤备用。不易过滤的样液可用离心机离心分离，上清液供测定用。,（2）蛋白性食品固体试样混匀后精密称取5.010.0g，精确至0 001g；液体试样用移液管精密吸取5.010.0 mL于 100mL棕色容量瓶内。加 10 mL 2molL乙酸溶液，乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各75mL，加水定容。将全部溶液移入离心管内，以3000 rmin离心10 min，上清液供测定用。同时取与处理试样相同量的乙酸溶液、乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，按同一方法做试剂空白对照。,2标准曲线绘制 取一套10 mL比色管，编号，按表312加入各试剂。表312 试剂配加表,各管加水稀释至10 mL，混匀并在室温下放置20 min后，用1cm比色皿，以零号管为参比，于420 nm处测定吸光值。以抗坏血酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。,绘制标准曲线方法：1）绘制标准曲线2）计算回归方程后，再绘制标准曲线计算回归方程方法:按照回归方程进行计算;应用excel进行计算;电脑连接的分光光度计直接出数据。,3样品测定（1）非蛋白试样的测定 于二个比色管内精密吸取按非蛋白性食品方法处理的样液0.55.0 mL（约相当于抗坏血酸200 g以下）和等量蒸馏水，以下按标准曲线测定方法依次加入其他试剂。加水稀释至10 mL，混匀并在室温下放置20 min后，以未加样品管为参比，测定样品吸光值，从标准曲线上查出抗坏血酸含量。（2）蛋白性试样的测定 于两个 10mL比色管内精密吸取按蛋白性食品方法制备的样液（约相当于抗坏血酸 200 g以下）和等体积试剂空白溶液。各加入 1.5 mL乙二胺四乙酸二钠溶液、0.5 molL乙醇溶液1.0 mL、1.25mL固蓝盐B溶液，加水定容。室温下放置3min后，移入1 cm比色皿，以试剂空白管为参比，于420 nm处测定吸光值。从标准曲线上查出抗坏血酸含量。,（五）结果计算 按式（314）计算样品中抗坏血酸含量，计算结果保留小数点后二位。,式中 X每百克（或百毫升）样品中抗坏血酸含量，mg；C试样测定液中抗坏血酸含量，g；m试样质量或体积，g或mL；V2试样处理液总体积，mL；V1测定时所取溶液体积，mL。,（六）注意事项及说明 1蛋白性食品常指奶粉、豆粉、乳饮料、强化食品等。2蛋白性试样比色测定时，以试剂空白管为参比的目的，在于消除蛋白质沉淀剂可能产生的呈色物质，减少实验误差。（七）思考题 1比较 2，4二硝基苯肼法与固蓝盐 B比色法测定抗坏血酸的适用性。2样品溶液制备时加入乙酸溶液有何目的？对蛋白性食品若不进行除蛋白步骤，会对实验产生哪些影响？,
