宋存江《生物技术概论》4.发酵工程.ppt

4 发酵工程,学习目的 掌握发酵工程的基本类型和基本原理，了解典型发酵产品的生产工艺，认识发酵的基本过程及常用的发酵设备。,发酵工程是一门将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。它以培养微生物为主，所以又称微生物工程。,发酵工程 4 发酵工程,发酵的定义,发酵（fermentation）最初来自拉丁语“发泡”（fervere），是指酵母作用于果汁或发芽谷物产生CO2的现象。生物化学上将发酵定义为“微生物在无氧时的代谢过程”。目前，人们把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵。,4 发酵工程 引言,微生物发酵工程:是利用微生物的生长繁殖和代谢活动以及特定功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系。是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。,微生物菌体发酵 微生物酶发酵 微生物代谢产物发酵微生物的转化发酵 生物工程细胞的发酵,4.1 发酵工程概况,发酵类型,发酵工程 4 发酵工程,微生物代谢产物,在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。,发酵工程 4.1.1 发酵类型,微生物代谢产物类型,发酵工程 4.1.1 发酵类型,微生物工业的一些轻化工产品,微生物的转化发酵,4.1.2 发酵技术的特点,发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成。反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单。原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源（如植物秸秆、木屑等），微生物本身能有选择地摄取所需物质。,发酵工程 4.1 发酵工程概况,容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应。发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。,发酵工程 4.1.2 发酵技术的特点,4.1.3 发酵技术的应用,医药工业,抗生素、维生素、激素疫苗和菌苗等,发酵工程 4.1 发酵工程概况,粘细菌（Myxobacteria）是一类能够产生多种生理活性物质的微生物。近10年的研究已经昭示出粘细菌具有广阔的开发利用空间。在20世纪70年代，首次报道粘细菌产生的活性次级代谢产物是三烯吡喃菌素（ambruticin）。目前已从粘细菌中发现了大约600多种生理活性物质。与其它的药源菌相比，粘细菌具有独特的优势和巨大的潜力。,粘细菌产生的生理活性物质,埃博霉素产生菌-纤维堆囊菌营养细胞,（山东大学李越中教授提供）,是一种新的16元环多酮大环内酯，含有一个噻唑基和环上的一个环氧结构。该菌产生A和B两种主要组分,C-F四种次要组分以及36种极微量成分。这类物质的作用机制与紫杉醇类相似，它与微管蛋白结合，干扰细胞骨架的形成，起到抗肿瘤作用。近年来，对这类物质的化学合成，构效关系以及药效学等的研究进展很快，有望成为比紫杉醇更好的临床抗肿瘤药物。图15-20所示为从纤维堆囊菌发酵液中分离到的埃博霉素A，B，C，D和F的化学结构。,埃博霉素类抗肿瘤物质,粘细菌 Soarngium cellulosum 产生的埃博霉素类化学结构,食品工业,微生物蛋白、氨基酸、新糖源、饮料、酒类食品添加剂（柠檬酸、乳酸、天然色素等）,发酵工程 4.1.3 发酵技术的应用,发酵法生产的一些氨基酸及其用途,能源工业,酒精沼气氢能,发酵工程 4.1.3 发酵技术的应用,化学工业,可降解的生物塑料化工原料（乙醇、丙酮、丁醇、癸二酸等）生物表面活性剂及生物凝集剂,发酵工程 4.1.3 发酵技术的应用,利用微生物合成生物降解材料-聚羟基脂肪酸脂(PolyhydroxyalkanoatePHA)众所周知，微生物的营养因素包括：碳源、氮源、无机盐、微量元素、水和生长因子（氨基酸、维生素和嘌呤或嘧啶）当 环境中，缺少氮源而碳源浓度又比较高时、一部分微生物体内就积累一些颗粒、被分离纯化后即为具有热塑性的生物降解高分子材料。现已知有300余种细菌可以积累单体在90种以上的 PHA,Pseudomonas mendocina NK-01,Pseudomonas mendocina NK-01 PHA,从门多萨假单胞菌NK-01基因组中获得的中长链PHA合成酶 phaC1基因构建重组载体pBSphaC1，在E.coli JM109 中进行表达，以所构建的工程菌株进行PHA的发酵量重组大肠杆菌合成的PHA结构分析表明，工程菌合成的PHA中含有六碳和八碳单体,冶金工业,黄金开采和铜、铀等金属的浸提,发酵工程 4.1.3 发酵技术的应用,发酵过程的场所 微生物冶金-冶金装置,CuFeS2+2 Fe2(SO4)3+2H2O+3O2 CuSO4+5FeSO4+2 H2SO4,氧化亚铁硫杆菌 和 氧化硫硫杆菌,农业,生物固氮生物杀虫剂微生物饲料,发酵工程 4.1.3 发酵技术的应用,环境保护,使用生物肥料，生物杀虫剂降解有毒物质净化废水废气，处理石油污染,发酵工程 4.1.3 发酵技术的应用,发酵过程的场所 污水处理-污水处理池,发酵过程的场所 微生物采油-油田,依靠人工注水，外加压力来保持地层的能量的方式进行开采。水驱后原油采收率平均达到40-45%。,发酵过程的场所 微生物采油-油田,依靠人工注水，外加压力来保持地层的能量的方式进行开采。水驱后原油采收率平均达到40-45%。,驱油菌主要是通过对原油的降解，使得原油的组分发生变化，原油的流动性变好。驱油菌在生长代谢过程中，能够产生生物表面活性剂等代谢产物，有效地降低了油水间的界面张力；提高采收率潜力提高。由于驱油菌的代谢作用和在位繁殖效应，使原油的渗流阻力进一步下降，润湿性发生反转，原油被乳化成水包油型乳状液，孔隙中不可动油开始启动,4.2 微生物发酵过程,微生物发酵过程即微生物反应过程，是指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。,发酵工程 4 发酵工程,好氧性发酵,在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气。如利用黑曲霉进行的柠檬酸发酵，利用棒状杆菌进行的谷氨酸发酵，利用黄单孢菌进行的多糖发酵等。,发酵工程 4.2 微生物发酵过程,厌氧性发酵,在发酵时不需要供给空气。如乳酸杆菌引起的乳酸发酵，梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。,发酵工程 4.2 微生物发酵过程,固体发酵液体发酵,敞口发酵密闭发酵浅盘发酵深层发酵,液体深层发酵,发酵工程 4.2 微生物发酵过程,固态发酵生物活性物质,4.2.1 发酵工业中的常用微生物,细菌放线菌酵母菌霉菌其他微生物,发酵工程 4.2 微生物发酵过程,放线菌,小白链霉菌NK660的电镜照片,-聚赖氨酸结构简式,4.2.2 培养基,培养基是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。,发酵工程 4.2 微生物发酵过程,霉菌,孢子培养基 种子培养基 发酵培养基,4.2.2.1 培养基的种类,发酵工程 4.2.2 培养基,细菌,酵母菌,4.2.2.2 发酵培养基的组成,碳源,葡萄糖、果糖蔗糖、麦芽糖淀粉、纤维素等,发酵工程 4.2.2 培养基,氮源,有机氮源（黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母粉等）无机氮源（氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等）,发酵工程 4.2.2.2 发酵培养基的组成,无机盐和微量元素,磷酸盐、硫酸盐、氯化钠、氯化钾镁、铁、钴、锌、锰等,发酵工程 4.2.2.2 发酵培养基的组成,蓝藻,生长因子,维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶的衍生物以及脂肪酸等。酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和一些动植物组织的浸液，是生长因子的丰富来源。,发酵工程 4.2.2.2 发酵培养基的组成,水,水是培养基的主要组成成分。它既是构成菌体细胞的主要成分，又是一切营养物质传递的介质，而且它还直接参与许多代谢反应。,发酵工程 4.2.2.2 发酵培养基的组成,产物形成的诱导物、前体和促进剂,如合成青霉素G的苯乙酸，合成红霉素的丙酸等,发酵工程 4.2.2.2 发酵培养基的组成,发酵的一般过程,发酵工程 4.2 微生物发酵过程,4.3 液体深层发酵,4.3.1 发酵的操作方式,4.3.1.1 分批发酵 营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。传统的生物产品发酵多用此过程。,发酵工程 4 发酵工程,根据不同发酵类型，每批发酵需要十几个小时到几周时间。全过程包括空罐灭菌、加入灭过菌的培养基、接种、发酵过程、放罐和洗罐，所需时间的总和为一个发酵周期。,发酵工程 4.3.1.1 分批发酵,典型的分批发酵工艺流程图,发酵工程 4.3.1.1 分批发酵,微生物分批培养的生长曲线,1.延滞期 2.加速生长期 3.指数生长期 4.减速期 5.稳定期 6.衰亡期,发酵工程 4.3.1.1 分批发酵,4.3.1.2 连续发酵,以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。,发酵工程 4.3.1 发酵的操作方式,4.3.1.3 补料分批发酵,又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。,发酵工程 4.3.1 发酵的操作方式,4.3.2 发酵工艺控制,温度对发酵过程的影响是多方面的，它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制。除这些直接影响外，温度还对发酵液的理化性质产生影响，如发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。,发酵工程 4.3 液体深层发酵,4.3.2.1 温度,pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用；pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。另外，pH值还会影响某些霉菌的形态。,发酵工程 4.3.2 发酵工艺控制,4.3.2.2 pH值,对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。好氧性微生物在进行深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。现在可采用复膜氧电极来检测发酵液中的溶解氧浓度。,发酵工程 4.3.2 发酵工艺控制,4.3.2.3 溶解氧浓度,4.3.3 发酵设备,一个优良的发酵装置应具有严密的结构，良好的液体混和性能，较高的传质、传热速率，同时还应具有配套而又可靠的检测及控制仪表。,发酵工程 4.3 液体深层发酵,发酵工程 4.3.3 发酵设备,发酵罐及其控制系统,机械搅拌式发酵罐是发酵工厂常用的类型之一。它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，促进氧的溶解，以保证供给微生物生长繁殖和代谢所需的溶解氧。,发酵工程 4.3.3 发酵设备,4.3.3.1 机械搅拌式发酵罐,2012年5月16日自此页开始,发酵工程 4.3.3.1 机械搅拌式发酵罐,在通风搅拌式发酵罐中，通风的目的不仅是供给微生物所需要的氧，同时还利用通入发酵罐的空气，代替搅拌器使发酵液均匀混合。,发酵工程 4.3.3 发酵设备,4.3.3.2 通风搅拌式发酵罐,小型发酵罐,厌氧发酵也称静止培养,因其不需供氧,所以设备和工艺都较好氧发酵简单。严格的厌氧液体深层发酵的主要特色是排除发酵罐中的氧。酒精、丙酮、丁醇、乳酸和啤酒等都是采用液体厌氧发酵工艺生产的。,发酵工程 4.3.3 发酵设备,4.3.3.3 厌氧发酵设备,啤酒发酵罐,发酵工程 4.3.3.3 厌氧发酵设备,4.3.4 下游加工过程,从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程。,发酵工程 4.3 液体深层发酵,双效浓缩器,离心机,结晶罐,下游加工的工艺流程,发酵工程 4.3.4 下游加工过程,4.4 固体发酵,原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业中的副、废产品；一般都是开放式的，无菌要求不高；所需设备简单，操作容易；劳动强度大，不便于机械化操作，微生物品种少、生长慢，产品有限。,发酵工程 4 发酵工程,固体发酵实例,发酵工程 4.4 固体发酵,青霉素是最早发现并用于临床的一种抗生素。1928年为英国人Fleming A.发现，20世纪40年代投入工业生产。,4.5 典型产品的发酵生产,发酵工程 4 发酵工程,4.5.1 抗生素发酵生产,目前全世界用于生产青霉素的高产菌株，大都由菌株Wis Q176（一种产黄青霉，Penicilliumchrysogenum）经不同改良途径得到。青霉素工业发酵生产水平已达85000 U/mL以上。,发酵工程 4.5.1 抗生素发酵生产,4.5.1.1 青霉素发酵生产菌株,碳源：淀粉经酶水解的葡萄糖糖化液。氮源：玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼 粉或麸皮。前体：苯乙酸或苯乙酰胺。无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。,发酵工程 4.5.1 抗生素发酵生产,4.5.1.2 青霉素发酵生产培养基,青霉素发酵工艺,冷冻管,斜面母瓶,孢子培养,25，67天,大米孢子,孢子培养,25，67天,一级种子罐,种子培养,25，4045h，12vvm,二级种子罐,种子培养,25，1315h，11.5vvm,发酵罐,发 酵,2226，110.8vvm，67天,放罐,提炼,冷至15,发酵工程 4.5.1 抗生素发酵生产,过滤：采用鼓式真空过滤器；提炼：溶媒萃取法；脱色：活性炭脱色；结晶：丁醇共沸结晶法。,发酵后处理,发酵工程 4.5.1.3 青霉素发酵工艺,谷氨酸是目前氨基酸生产中产量最大的一种，谷氨酸发酵生产工艺也是氨基酸发酵生产中最典型和最成熟的。谷氨酸发酵生产菌种主要有棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、小杆菌属（Microbacterium）及节杆菌属(Arthrobacter)的细菌。,发酵工程 4.5 典型产品的发酵生产,氨基酸发酵生产,谷氨酸棒状杆菌,谷氨酸发酵生产以淀粉水解糖为原料。谷氨酸提取有等电点法、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法，以及将上述方法结合使用的方法。国内多采用的是等电点离子交换法。,发酵工程 4.5.2 氨基酸发酵生产,谷氨酸钠味精,维生素的生产多采用化学合成法，后来人们发现某些微生物可以完成维生素合成中的某些重要步骤，在此基础上，化学合成与生物转化相结合的半合成法在维生素生产中得到了广泛应用。目前可以用发酵法或半合成法生产的维生素有维生素C、B2、B12、D，以及-胡萝卜素等。,发酵工程 4.5 典型产品的发酵生产,维生素发酵生产,维生素C的化学合成方法一般指莱氏法，后来人们改用微生物脱氢代替化学合成中L-山梨糖中间产物的生成，使山犁糖的得率提高一倍，我国进一步利用另一种微生物将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，再经化学转化生产维生素C，称为两步法发酵工艺。这种方法使得维生素C的产量得到大幅度提高。第一步发酵所用菌株是生黑葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter melanogenus)或弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)；第二步发酵的菌株是氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)和条纹假单胞杆菌（Pseudomonas striata）。,发酵工程 4.5.3 维生素发酵生产,微生物发酵产物有哪几种类型？发酵培养基由哪些成分组成？比较分批发酵、连续发酵和补料分批发酵的优缺点。下游处理过程分为哪几个步骤？相应的分离方法有哪些？简述青霉素的生产工艺。,复习思考题,发酵工程 4 发酵工程,1刘如林.微生物工程概论.天津：南开大学出版社.19952熊宗贵.发酵工艺原理.北京：中国医药科技出版社.19953俞俊棠，唐孝宣.生物工艺学（上、下）.上海：华东化工学院出版社.19924焦瑞身.微生物工程北京：化学工业出版社.20035姚汝华.微生物工程工艺原理.第二版.广州：华南理工大学出版社.20056朱圣庚等.生物技术.上海：上海科学技术出版社.19957Smith John E.Biotechnology.3rd ed.Cambridge University Press.1996,主要参考文献,发酵工程 4 发酵工程,