多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用.ppt

,多重连接探针扩增技术及其应用,深圳市天大生物医疗器械有限公司苏海静 副总经理,MLPA技术简介,主要内容,MLPA技术特点与主要应用领域,MLPA技术工作流程,数据分析(Coffalyser的使用),MLPA技术简介,MLPA:多重连接探针扩增技术,主要应用领域：多重检测人类基因组序列中微小的拷贝数变异该技术于2002年首次发表：Schouten JP et al:Nucleic Acids Res.30:e57。发表的MLPA技术相关的文章超过一千篇。每年运行的MLPA测试超过一百万次。使用MLPA技术的实验室超过一千个并分布于在80个不同的国家。荷兰MRC公司提供MLPA试剂盒包括了300多种的应用领域：-人类基因组学-分子细胞遗传学-肿瘤诊断学,多重连接探针扩增技术原理,1.变性&2 杂交,PCR 上游引物,杂交序列,PCR 下游引物,上下游杂交探针彼此相邻，由热稳定的连接酶连接。,3.连接,目标序列 B,X,5,5,3,Y,X,5,5,3,目标序列 A,Y,5,3,目标序列 A,目标序列 B,5,3,间隔序列(对于不同探针长短不同),4.PCR,每种探针的扩增产物都有自己特异的标志性长度（130-480 bp）。,5,3,5,3,X,Y,5,3,X,Y,5,3,所有连接产物均由同一对引物进行PCR扩增。,5.毛细管电泳分析扩增产物,通过与对照DNA标本比较相同片段长度峰高的不同来确定目标序列的对拷贝数变化。,Schouten,J.P.et al.Nucl.Acid Res.30,e57.,5,5,5,EcoRV,SphI,XbaI,BsmI,“Stuffer”sequence,PCR primer sequence,(vector:blue plaques),EcoRV,SphI,XbaI,BsmI,“Stuffer”sequence,PCR primer sequence,(clone:white plaques),EcoRV,BsmI,人工合成的杂交序列被克隆到来源于M13的SALSA载体上。每个SALSA 载体都包括了一段不同长度的间隔序列。,通过克隆获得单链 DNA。将两个短的寡核苷酸序列与单链DNA退火，从而获得带BsmI and EcoRV位点的双链DNA。,Hybridising sequence,经EcoRV and BsmI酶切后,可以获得85-440 nt长的探针序列.,“Stuffer”sequence,Hybridising sequence,PCR primer sequence,右侧杂交探针的制备,MLPA 工作原理特点,1、检测对象为和两条MLPA探针完全配对的样品DNA序列；2、扩增对象是杂交在样品上的两条探针由连接酶进行连接之后的产物；3、不同基因的连接产物长度不同；4、多重的连接产物能够被同一对引物扩增；PCR具有高度的同步性；5、扩增产物（大小一般为130-500nt)用于毛细管电泳分析；6、基因拷贝数变化直接体现在毛细管电泳结果的峰面积差异；7、基因点突变体现在扩增峰缺失；8、,所需仪器,只需普通PCR仪和一台测序用的毛细管电泳仪。耗时在24小时以内。,MLPA 工作流程,MLPA 的操作流程,变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。,MLPA 质控片段可以识别 DNA样品浓度是否合适,每个MLPA 探针混合液都包括质控片段,当DNA样品量不足时，4个质控片段（64-70-76-82 nt）的峰会产生很高的信号当DNA样品变性不完全时，两个探针(88-96 nt)会给出警示信号.X 染色体(100 nt)和 Y 染色体(105 nt)片段可以指示样本是否置换.,TE,98 oC.,TE,94 oC.,TE,98 oC.,TE,82 oC.,TE,98 oC.,TE,76 oC，并不是所有的染色体区域都变性,DNA样本的要求,MLPA反应要求基因组DNA的使用量范围为20-500 ng。为了减少差异，尽量使用与待测样本来源相同和提取方法一致的样本作参照。长时间的存储和反复冻融可能会影响样本的质量和MLPA的检测结果。一些污染物可能会影响MLPA的结果（如影响模板变性或PCR扩增）。,DNA 变性,Tm 依赖于 GC含量.Tm 受盐离子浓度影响，当盐浓度提高10倍时，Tm可以提高10倍.DMSO/甲酰胺可以降低Tm.其它的化合物?,TE,98 oC.,TE+50 mM KCl;98 oC.,TE,98 oC.,TE+50 mM KCl;94 oC.The presence of 50 mM salt results in a much higher melting temperature.Some sequences in strong CpG islands are not denatured at 94 oC.,TE,98 oC.,TE+1.6 mM MgCl2,98 oC.即使是在 98 C，一些 CpG 岛区域 并不能完全变性（TE+低浓度MgCl2）,98 oC 加热80分钟,98 oC 加热20分钟,98 oC 加热5分钟,由于MLPA探针识别序列仅约70nt，因此可用于DNA碎片的检测，即使长时间的对DNA样品加热导致其断裂也不会对最终检测结果造成大影响。,可检测降解DNA,MLPA工作流程,变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后，在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。,杂交,溶液体积:8 L 杂交时间 60 C杂交16小时，即使是延长到20小时也可以。溶液的盐浓度:盐浓度在杂交反应中为 350 mM。杂交温度:杂交 温度 62 C会导致杂交探针不稳定；杂交温度 60 C 会导致杂交速度变慢。,MLPA工作流程,变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。,连接,连接反应 90%在两分钟之内完成，连接反应在 5 min到25 min都可以。DNA连接酶的量非常重要过量的DNA连接酶易造成非特异连接连接反应中盐浓度降低到75 mM.，由于探针Tm在低盐时会降低,故连接反应温度降低到54 oC。连接酶为NAD(Ligation buffer A)和镁离子（ligation buffer B）依赖的，因此，buffers A and B不能反复冻融。,MLPA工作流程,变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。,PCR反应,引物混合液包含了一条荧光标记引物和一条未标记引物和 dNTPs.对于不同的型号的毛细管电泳仪,可能需使用不同荧光标记的通用引物,其中ABI系列的毛细管的电泳仪需使用FAM标记的通用引物，Beckman系列的需使用Cy5.0标记的通用引物。SALSA DNA聚合酶与Taq DNA聚合酶类似，但浓度更高.有些探针对DNA酶活性较为敏感，由于 DNA纯度可以影响DNA聚合酶活性，故DNA不纯可以导致部分探针信号较低。要求质控DNA与样本DNA提取方法一致.PCR循环数影响不是很大.PCR终止是由于引物的消耗完.,MLPA工作流程,变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。,毛细管电泳,需要将片段大小和峰面积导到Excel中分析结果Coffalyser（）.,MLPA技术特点与主要应用领域,MLPA 技术特点,单管PCR反应检测50种DNA序列的拷贝数差异。MLPA应用的拓展：-mRNA的相对定量-检测启动子区域的甲基化异常-检测已知突变如BRAF V600E只需20ng人类基因组DNA的模板量（相当于3000个细胞）。可以区别目标序列中的单碱基突变。MLPA技术可以检测已经部分降解的标本如石蜡包埋标本和福尔马林浸泡组织标本。MLPA适用于目标序列的相对拷贝数差异检测，对于在X性染体和三体细胞中的DNA序列由于自身染色体数目发生变化而无法进行区分。,一、突变检测,虽然目前测序、DHPLC、SSCE、HRM等多种技术能够用于点突变检测，但是无法同时针对整个外显子的DNA序列的缺失或重复进行检测。而MLPA技术即使在某个基因缺失的情况下也可以对其他基因进行PCR扩增和序列确认，从而反映真实的情况。FISH技术不能够检测小于20kb的DNA缺失，Southern blots则操作繁琐。实时荧光PCR缺乏对较小的拷贝数差异的检测能力低而且无法多重检测。QFPCR则不如MLPA稳定而且无法达到50重的检测体系。不同基因的外显子缺失突变概率并不相同-通常情况下有5%检测到的突变为缺失突变-在有些基因中比例可达到5-20%（如：APC,MSH2,SPAST,PARK等）-对于DMD基因，有65-70%的突变为缺失突变或序列重复。MLPA探针混合体系可以同时检测多达100个基因。通常情况下，一对探针可以代表该基因所在的外显子情况，包括小拷贝数的缺失或重复。BRCA1,MSH2,MSH6,MLH1,DMD,APC,NF1,NF2,VHL,FBN1,PARK,CFTR,SPAST,RB1,NSD1,MECP2,BRCA2。,实例一：试剂盒P163-B1（Lot 0208）探针混合体系中的四对探针检测出了耳聋GJB6基因中309KBDNA序列缺失突变情况。,杂合缺失突变(GJB6-D13S1830),GJB6 deletion detected by 4 probes,X,X,X,X,正常对照DNA标本,病人标本,二、微小缺失综合症,SALSA MLPA P245 试剂盒能够单管同时检测20种微小缺失综合症！在P245探针混合体系中针对每种微小缺失综合症都有2-3条探针进行检测。该探针混合体系可被用作儿童发育延迟等症状病人DAN样品的检测试剂盒。P371-P374这四个试剂盒则是针对这20种微小缺失综合症中某一种分别设计8-10条探针，用于确认P245试剂盒检测出的缺失或重复突变所处的位置。该混合体系也可以4x25反应的一个四联装的试剂盒形式购买。当已经出现明确是那种症状时，最好选择特定的SALSA MLPA试剂盒做有针对性的微小缺失综合症检测，这样在特定区域内可以有更多的检测探针覆盖而且有可能发现更小的非典型的缺失突变，例如：-P250 试剂盒用于 DiGeorge 综合症的检测，P026试剂盒用于 Sotos综合症的检测，P015试剂盒用于 RETT综合症的检测。对于 Prader-Willi/Angelman 和 Beckwidt-Wiedemann/Silver Russell 综合症,推荐使用MS-MLPA探针混合体系以便对单亲源二倍体造成的甲基化水平差异进行检测。,Reference DNA sample,先天性胸腺发育不全病人DNA标本,正常对照DNA标本,实例二：试剂盒P245（Lot 0909）可有检测21种不同的微小缺失综合症，其中三对探针用于检测22号染体长臂上的DiGeorge区域缺失突变情况。,实例三：试剂盒P372（lot 0509）是用于进一步细化确认试剂盒P245检测结果的四个试剂盒之一。其十对探针均用于检测DiGeorge区域缺失突变情况。,正常对照DNA标本,先天性胸腺发育不全病人DNA标本,实例四：P245探针混合体系对威廉综合症病人的初步诊断，其中三条探针用于检测7q11.23区域的缺失突变。,正常对照DNA标本,威廉综合症病人DNA标本,三、亚端粒异常筛查,试剂盒P036和P070探针混合体系针对每一种亚端粒区域均设计有一条探针进行单管检测。对于P036和P070试剂盒给出的任何一个亚端粒区域的检测结果，都配套的探针混合体系可用做下一步的细化分析。-例如：试剂盒P208的探针混合体系带有12探针针对9号染色体长臂，8条探针针对10号染色体长臂，14条探针针对11号染色体长臂，9条探针针对12号染色体长臂，覆盖区域均为染色体末端6Mb以内。对于患有智力障碍的病人，我们推荐联合使用P245微小缺失诊断试剂盒和P036亚端粒诊断试剂盒。由于MLPA技术所需的成本相对较低，因此可以对患有轻微智力障碍的病人进行疾病筛查。试剂盒P181和P182包含有检测端粒区域的探针混合液，可用来分析样品中的目标染色体易位情况。,四、脊髓性肌肉萎缩症诊断,SMN1和SMN2基因与该疾病密切相关这两个基因仅在7号外显子上有一个碱基的差异P021 SMA试剂盒应用于-SMN1和SMN2基因的拷贝数变异检测-区分正常人群和脊髓性肌肉萎缩症病人P060 SMA试剂盒应用于-SMN1的拷贝数变异检测-对基因携带者进行筛查可以区分零拷贝，单拷贝，双拷贝，三拷贝，四拷贝SMN1和SMN2基因多种情况。通过一次MLPA反应的检测有95%的概率找出该病的发生原因。,实例五：P060 SMA 试剂盒检测 SMN1拷贝数变异,正常对照：2拷贝的SMN1,携带者：1拷贝的SMN1,正常对照,SMA 携带者,实例六：P021 SMA 试剂盒检测 SMN1+SMN2拷贝数变异,五、肿瘤诊断,单管同时检测拷贝数变异和核苷酸点突变例如IDH1和BRAF V600E试剂盒P004/P078：检测乳腺癌，包括Her2-neu基因试剂盒P202/P335：检测IKZF1/Icaros等ALL目标基因试剂盒P037-38-40：检测CLL基因；P251-252-253：检测成神经细胞瘤相关基因试剂盒P377：检测血液恶性肿瘤相关基因试剂盒P027：检测葡萄膜恶性黑色素瘤相关基因以及其他试剂盒,正常对照样品,ERBB2=Her2-neu,ERBB2,ERBB2,NeuroD2,乳腺癌样品,实例七：试剂盒 P004 用于检测 Her2-neu 拷贝数变异,正常对照样品,BRCA1,BRCA1,乳腺癌样品,实例八：试剂盒 P004 检测其他拷贝数变异如 BRCA1 缺失,MLPA技术今后的研发方向,遗传药理学:拷贝数变异+点突变/SNPs肿瘤诊断学:拷贝数变异+甲基化差异+原有的检测位点如：IDH1,BRAF V600E,NRAS,JAK2 V617F微生物分析:SNPs+拷贝数多少。每周都会收到多个开发新的应用要求的来函。平均每周多会开发出一种新的MLPA探针混合体系。由于我们不可能精通所有领域，因此本公司产品都采取与医院或大学协同开发的形式完成。,MS-MLPA技术,MS-MLPA 操作流程,1.变性样品DNA在98度下加热10分钟。.2.杂交往变性后的样品中加入 SALSA 探针混合液和MLPA 缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。3.连接（分两部分进行）常规连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。甲基化检测连接在杂交产物中加入连接酶混合液和HhaI酶（识别非甲基化的GCGC）在49度下温浴连接30分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。4.PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。执行PCR反应。5.毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。,甲基化目标序列,第一种情况：目标序列没有甲基化 连接+酶切 不扩增,未甲基化目标序列,1.变性杂交,检测探针能够进行连接但连接产物被酶切,3.不能进行扩增,附加说明：由于连接反应和酶切反应同管同时进行，所以识别甲基化的限制性内切酶的酶切位点在杂交序列的哪个位置上并没有太大的影响。由于这两个反应同时进行，因此限制性内切酶不仅酶切了未甲基化的DNA样品而且酶切了探针和样品的杂交产物。因此，我们对原有的反应程序进行校正。在新的反应程序中，未甲基化的目标序列不管处于探针杂交的哪个位置上总是会受到酶切（如图中第一种情况），即使酶切位点和连接位点的位置离的很远。新的反应程序还具备易于操作的优点。,2.连接并用识别甲基化的限制性内切酶酶切,1.变性杂交,2.连接并用识别甲基化的限制性内切酶酶切,检测探针能够进行连接且连接产物不会被酶切,3.能够进行扩增,第二种情况：目标序列甲基化 连接+不酶切 能够扩增,MS-MLPA技术 原理图,不会被HhaI切割（肿瘤标本）,被HhaI切割(正常血液DNA）剩余的探针：没有HhaI识别位点,其中15条探针不带HhaI位点，26条探针带HhaI位点。在正常血液标本中这些位点都未甲基化但是在肿瘤DNA标本就有可能发生甲基化。,实例九：试剂盒ME001检测抑癌基因甲基化,MLPA技术的优点,多重检测：可以单管同时检测40-50重数的不同基因拷贝数变化。需要样本量少：只需20 ng人的基因组DNA（相当于3000个细胞或0.5 mL羊膜穿刺液）。使用的仪器少：只需一台普通PCR仪和测序用的毛细管电泳仪。高通量：24小时内出结果。稳定性好：提供大包装试剂盒（50,000个反应），所有试剂已被证明稳定。易于定量：所有试剂均为液相。成本较低：包括毛细管电泳，试剂总成本低于15欧元/反应。,MLPA技术的缺点,MLPA技术不能用于单细胞检测，至少需要3000个细胞。MLPA技术目前还不能应用于全基因扩增的样品。MLPA技术无法检测染色体平衡易位，MLPA带有的端粒特异性检测探针可以检测绝大部分的染色体不平衡易位。MLPA技术无法区分女性三倍体和两倍体细胞。MLPA技术用于mRNA定量时对样品选择有特殊要求，而且动力学曲线受限。发展新的基于M13噬菌体技术合成检测探针耗时和困难，因此对于科学研究，越来越多的实验室选择化学合成。,谢谢,