基因组序列组装的理论与方法(简介).ppt
基因组序列组装-理论与方法,北京大学生物信息中心科学院北京基因组研究所李松岗,两种测序策略,分级鸟枪法(BAC TO BAC)基因组DNA 切成大片段 构建BAC文库挑选 构建小片段shotgun文库 测序 组装BAC序列 组装基因组序列全基因组鸟枪法基因组DNA 构建不同长度shotgun文库 测序 组装基因组序列,基因组测序与组装示意图,基于BAC方法的 优缺点,优点：组装被局限在BAC的范围内，受重复序列影响小，对计算能力要求不高；缺点：需要大量前期生物学研究工作，效率低，成本高。,全基因组鸟枪法优缺点,优点：不需要生物学前期准备，速度快，成本低；缺点：组装是在全基因组范围内进行，数据量大，易产生错拼；对计算机软硬件要求均高。,对拼接软件的要求,能充分利用正反向测序的配对信息,避免重复序列造成的错误拼接能处理数以百万甚至千万计的数据 程序并行化 高效率比对,能够采用全基因组鸟枪法的关键技术进步：毛细管测序仪的普遍使用计算机能力的迅速提高,Hierarchical Shotgun(HS),Whole Genome Shotgun(WGS),the sequencing of the human genome is likely to be the only large sequencing project carried to completion by the methods described in this issue.Maynard V.Olson,The maps:Clone by clone by clone,Nature 409,816-818(2001),Shotgun法序列拼接,Consensus,Mis-Assembly(Inverted),术语鸟枪法测序数据的组装鸟枪法文库：目标基因组一定长度随机片段克隆的集合。正反向测序对：从同一个克隆片段两端分别测序所得到的一对序列。.插入片段长度：克隆载体中插入的外源DNA片段长度。片段连接群(contig)：用识别互相重叠的方法对测序数据进行拼接的结果。.Scaffold:用正反向测序对连接的非重叠片段连接群。LW-洞：由于没有测序数据覆盖而在组装结果中留下的洞。,重复序列分析覆盖度：基因组被测序数据覆盖的次数。重复数：一段DNA序列在基因组中出现的次数。深度：一段DNA序列在鸟枪法测序数据集中出现次数。例如一个转座子在基因组中出现N次，测序数据集的覆盖度为C,则这个转座子的平均深度为NC。20-mer 重复序列：任何深度超过为该数据集确定的重复序列标准的20-bpDNA片段。是数学定义的重复序列。重复序列洞：由于屏蔽重复序列而在组装结果中留下的洞。,组装结果的评价标准N50 大小：把组装出的contigs 或 scaffolds从大到小排列，当其累计长度刚刚超过全部组装序列总长度一半时，最后一个contig或scaffold的大小。单碱基错误率：与参考序列比较后发现的小尺度上的不同所占的比例。所谓小尺度，在这里通常指小于标准测序长度，即500bp。实际上常常只是几个碱基。错误组装的Contig：测序数据组装中出现的错误。由定义，它涉及的片段一般大于500-bp。包括与参考序列相比，插入、删除，以及在方向和次序上不同的片段。错误组装的Scaffold：把非重叠contig连接在一起时出现的错误。包括嵌套，错误的方向和顺序等。,Shotgun Sequencing Assembler Concepts,RePS:全基因组鸟枪法测序数据组装软件包,特点：通过屏蔽在鸟枪法测序数据中发现的重复序列来完成组装。,RePS的流程图,RePS2的新流程图,识别重复序列的数学模型,重复序列识别：,若repeat有m个拷贝，且已知随机序列覆盖深度为0，1，2的概率：g0，g1，g2，则一次抽样repeat覆盖深度为0，1，2，的概率P0，P1，P2，为：,n次抽样，其中i次以上深度在j以上的概率Pij,设一次抽样深度在j以上和以下的概率分别为：Pj，Pj+；,n次抽样，其中i次以上深度在j以上则认为是repeat，此时犯两类错误的概率 为：,设repeat在基因组中的比例为b，出现概率为P，非repeat出现概率为P*，则：,Tradeoff between contig size and accuracy of assembly,重复序列识别效率,MDR(数学定义的重复序列)与 BDR(生物定义的重复序列),BDR(25%),BDR(50%?),MDR(42.2%),重复序列的检测与处理,插入片段大小引起的错误组装,人与水稻基因组中重复序列分布的差别,Contigs:127,550(N50=6,688 bp),Scaffolds:102,444(N50=11,764 bp),Quality:546 bp at Q20,插入片段长度的搭配,一般情况下，可采用如下设计：,CAP3（1999）,特点：删去read两端低质量部分；利用质量数据，识别重叠序列；进行多序列比对，得到一致序列；利用正反向数据纠正组装错误，构建scaffold。使用情况：仅使用数个BAC进行了测试。,果蝇组装软件（2000）,特点：组装前数据预处理；用数据库屏蔽重复序列；采用类似BLAST的方法找出重叠部分；选择不冲突的重叠构建contigs，识别重复序列边界；用正反向信息构建scaffolds，填洞。使用情况：用于果蝇基因组组装。,用于人类基因组组装时的改进（2001）,构建contigs后，利用一个统计模型识别低拷贝重复序列；采用两种方式利用已公布的人类基因组计划数据，即1.把人类基因组计划数据分解成“人工reads”，进行组装；2.利用人类基因组计划数据的定位对shotgun数据进行分组，然后组装。,ARACHNE（2002）,特点：组装前通过多序列比对纠正测序错误；考虑质量数据，对每对重叠reads打分；通过分析reads重叠情况识别重复序列的边界，组装的contigs避免越过边界；识别重复序列contigs；构建scaffolds，填补空洞。使用情况：使用数个物种，包括人21、22染色体数据进行了检验。,The Phusion Assembler（2003）,特点：输入数据包括正反向信息，插入片段长度在2-200kb之间；组装前先对数据进行分组，然后并行处理；使用phrap进行组装，组装过程中利用正反向信息对contig进行延伸或打断；根据重叠合并contigs；利用正反向信息构建scaffolds。使用情况：用于小鼠基因组，7.5x，2.6Gb，479 scaffolds,Table 2.Insert Sizes,Number of Reads and Effective CloneCoverage for the Mouse WGS Data Set,欧拉图方法（2001）,特点：放弃传统方法，用图论解决序列组装问题；每个read作为一个顶点，两个reads之间有重叠则有边连接。组装问题就化为找一条仅通过每个顶点一次的通路Hamilton问题。把重复序列视为粘在一起的边，可把上述图简化，问题变为找仅通过每条边一次的通路Euler问题。,具体步骤,纠正测序错误把read分为长为 L 的字。如果一个字属于M个以上reads，称为坚固的；否则称为弱的。纠正错误的算法，就是要通过最少的改变，使弱的字变为坚固的。通过这种方法，纠正了97.7%的测序错误，把每个read的平均错误率从4.8降到了0.11。,构建de Bruijn图顶点：长为L-1的字边：长为L的字，代表一条从前一个L-1字到后一个L-1字的有向边这样，就把测序数据转换成了de Bruijn图，组装问题变成了找Euler路径的问题。这一问题已有解法。使用情况：这一方法成功地用于一个多重复序列的细菌基因组。,
