固定化酶和细胞.ppt

Chapter 5 Immobilized Enzyme and Cell,固定化酶和细胞,制作：郑穗平,酶应用过程中的主要瓶颈,酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。,固定化技术,Contents of chapter 5,1、什么是固定化技术和固定化酶,2、固定化酶的研究历史,3、酶的固定化技术,4、固定化酶的特点,Go,Go,Go,Go,6、细胞、原生质体的固定化，自学,5、固定化酶的应用,Go,1 什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,酶的固定化技术和固定化酶,固定化酶的三种形式,固定化酶：经提取和分离纯化后的酶固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片 固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞,优点：不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；可连续化生产；稳定性好。缺点：1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻,固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。,2 固定化酶的研究历史,随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。,本章目录,3 酶固定化技术,活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。,固定化酶操作的注意事项,酶和细胞固定化的模式,吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。,包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。,根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等,首先被采用包埋法的酶有：固定化胰蛋白酶 固定化木瓜蛋白酶 固定化淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发剂,海藻酸钙包埋法装置,将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。,颗粒大小可实时监控,脂质体包裹酶,结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。,根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，,交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。,戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。,常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。,酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,本章目录,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联,酵母细胞表面展示技术,脂肪酶在毕氏酵母表面展示与筛选,C.antarctica 脂肪酶B及M.miehei 脂肪酶基因在酵母细胞表面的展示,4 固定化酶的特性：,将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。,本章目录,Aminoacylase 氨 基 酰 化 酶,5 固定化酶的应用,世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。,储罐,反应产物,消旋反应器,固定化酶柱子,晶体 L-Ala,L-Ala A-D-Ala,A-L-Ala A-D-Ala,DL-乙酰氨基酸拆分,高果糖浆的生产,世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。,2023/9/7,生产果葡糖浆的固定化酶反应器,K.Buchholz,et al.(Germany),2005;2008,This is the largest process performed with about 1500 t of immobilized enzymes producing a glucosefructose syrup(HFCS,high fructose corn syrup)with more than 10 million t of product(dry matter)per year,Typical fixed bed reactor,1220 t(dry substance,d.s.)per kg of biocatalyst with a half-life of 80150 days.Reactor dimensions typically are 1.5 m diameter and 5 m height of fixed bed bioreactors,with operation at 5860 C,青霉素酰化酶转化,填充床反应器连续生产(R)-1,3-丙二醇,b.固定化生物催化剂在异丙醇-水溶液体系中进行不对称氢转移生物还原,底物4-羟基-2-丁酮 5%产物(R)-1,3-丁二醇 49.5 g/l光学纯度 99%e.e.转化率为 99%反应器稳定工作 500 h反应器的生产率约为 750 mg/h/10 ml(催化剂),（Nobuya Itoh,2007）,a.固定化E.coli 细胞,生物催化不对称氧化还原CO2合成甲醇,（Ei-Zahab,et al.2008；Matsuda T.et al.2009）,四种酶，包括甲酸、甲醛、乙醇和谷氨酸脱氢酶 共固定化在一种颗粒上辅酶NADH固定在另颗粒上向两种固定化颗粒的悬浮液中通CO2气体进行反应实现了辅酶的内部循环该固定化系统表现出较好的循环使用的稳定性,酶和辅酶共固定化,环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒石酸,江苏常茂生化,常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的整细胞催化转化生产L-(+)-酒石酸，年生产规模6000吨，占世界市场15%，改变了传统从葡萄酒石提取的单一技术局面。,获得高酶活固定化细胞，单元反应柱生产能力增加50%，酶反应半衰期8个月以上，并且是世界上最大型的凝胶包埋固定化微生物细胞生产装置,大型固定化细胞装置,31,交联链孢霉菌细胞拆分DL-泛解酸内酯,交联 提高酶在有机底物体系中的稳定性,浙江鑫富 利用戊二醛交联固定化的链孢霉菌细胞(含内酯水解酶)催化拆分DL-泛解酸内酯，已实现D-泛酸钙和D-泛醇的大规模产业化年产量5000吨，占世界市场44%,5000L生物反应器,交联固定化菌体在反应,浙江鑫富药业,酶-化学耦联不对称合成左旋帕罗醇,原料利用率提高：底物近100%转化为目标产物，原子经济性大幅提高。节能减排效果明显：有机溶剂用量减少约59.3%、“三废”排放减少约39.4%。产品质量提高：ee 值大于99.5%（化学法99.0%）。,抗抑郁药帕罗西汀手性中间体左旋帕罗醇的合成,浙江九洲药业,工程菌，酯酶；大孔树脂固定化酶；重复使用20次以上（Industrial Engineering Chemistry&Research(2010,2008a,2008b),酵母展示脂肪酶在生物合成中的应用,酵母展示脂肪酶在短链芳香酯合成的应用,无水体系中不同酸醇摩尔比对合成己酸乙酯的影响,无溶剂体系下酶催化合成芳香酯,无水体系下合成芳香酯,酶传感器,酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。,酶电极,酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极。,葡萄糖酶电极,葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。,手掌型葡萄糖(glucose)分析仪,脲电极,产生的2NH4+为阳离子电极感应。,此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3,一些常见的酶电极,本章目录,