哺乳动物细胞表达重组蛋白.ppt

哺乳动物细胞培养制备重组蛋白质药物,按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统分为:,原核表达系统,酵母表达系统,植物表达系统,昆虫表达系统,哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高，与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物 学功能,发展历史和现状,1987年FDA批准了基因泰克公司生产的组织型纤溶酶原激活剂（tPA），世界上第一个哺乳动物细胞制备的重组蛋白质药物 标志着哺乳动物细胞制备重组蛋门时代的到来。,我国从2000年开始逐渐发展了该项技术，虽然起步较 晚，基础较差，但经过努力实现了该项技术的突破。,经过20多年的发展，哺乳动物细胞制备重组蛋白技术发生了巨大的变化。主要表现在,(1)细胞培养时间延长，由过去的7天延长至21天；(2)细胞密度增加，过去：1-2X106细胞毫升，现在：1-1.5X107细胞毫升；(3)产量增加，过去：1020pg重组蛋白细胞天，50一100mg重组蛋白升，现在：50-90pg重组蛋白细胞天，1-5g重组蛋白升。,哺乳动物细胞大规模生产重组蛋白的关键之处,表达载体 改进表达载体，提高表达水平和产量 分泌表达 下游纯化宿主细胞 新型细胞株的建立 培养工艺,一、真核表达载体,人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含：原核DNA序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因，便于 载体在原核细胞中扩增和大量制备。转录相关元件：哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子 元件，以及终止子和加polyA信号序列。翻译相关元件：有效的mRNA翻译信号 其它：视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入 位点等。,真核表达载体-启动子,外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。人巨细胞病毒的早期基因启动子和增加子(promoterenhancer)是最常用的启动子。高效启动子的发现和改构,内含子,某些内含子有重要的基因功能调控序列,目的基因以基因组形式克隆入载体能得到高表达。为增加转录产物的稳定性,表达载体中一般含有天然的或人工合成的内含子序列。,转录终止序列,真核基因的hnRNA的加工过程需要PolyA信号,在目的基因3端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。SV40的早期和晚期PolyA.,分泌表达载体,二、宿主细胞,以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备以下条件：细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征，便于大规模培养。遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存。合适的标记：便于转化株的筛选和维持。生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。,哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，常用的细胞系有 中国仓鼠卵巢细胞（CHO）人胚肾细胞HEK293,中国仓鼠卵巢细胞（CHO的优势,遗传背景清楚，生理代谢稳定,与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确,基因转移和载体表达系统完善,耐受剪切力，便于大规模培养,被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞,人胚肾细胞（HEK293）的优势,贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于293细胞的大规模培养。,在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度较低的培养基中。,具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因的高稳定性,三、培养工艺,为了减少成本和节约时问，近年来发展了大规模悬浮培养细胞瞬时转染技术,常用的商业化的离了脂质转染试剂，转染效率很高，但价格不菲,目前有两种试剂(磷酸钙和聚乙烯亚胺)可用以满足大规模培养瞬时表达,利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本,采用无血清无蛋白培养基(SFMPFM)来降低细胞培养和产品纯化的成本。双无培养基 但SFMPFM缺乏生长刺激因子、黏附因子、扩展因子以及其他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中细胞常表现出活力降低、贴壁性差等现象，进而导致分泌目的蛋白的能力下降。通过将生长刺激因子、黏附因子基因导入CHO细胞中，让CHO细胞本身提供其自身生长所需要的成分，使其能在SFMPFM中生长良好。,抑制细胞凋亡，延长培养周期,细胞在大规模培养初期，目的蛋白的表达和细胞的增殖速率呈正相关。但当反应器中细胞的密度达到饱和后，细胞继续增殖会导致养分和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代谢产物的大量积累，细胞逐渐凋亡，重组蛋白表达量逐渐降低。减少代谢产物的积累、在细胞密度达到理想值时使细胞处于增殖遏制期以及提高细胞的抗凋亡能力是宿主细胞改造的重要方向。通过降低产生代谢废物的基因的表达量或提高细胞的抗凋亡能力，都可以提高细胞的抗逆能力进而提高目的基因的表达。,