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沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法操作简便，成本低廉，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。,等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。,中性盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等也可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史。,盐析原理,首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态：两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞,水化层,蛋白质胶体溶液沉淀作用示意图,A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高；B、原料液体积很快地减小1050倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；C、对许多生物活性物质具有稳定作用D、操作简单、安全。,优点,缺点：,A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；B、过滤较困难,盐析法,Cohnx经验公式式中,S为蛋白质的溶解度(g/L)；I为离子强度；值为蛋白质在纯水中(I=0时)的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质pI时最小；Ks为盐析常数，与蛋白、盐种类有关，与温度和pH值无关。,例题：,牛血清白蛋白的盐析：由实验测得牛血清白蛋白在2.5 mol/L和3.5 mol/L（NH4）2SO4溶液中的溶解度分别为12g/L和0.006g/L，则它在3.0 mol/L（NH4）2SO4溶液中的溶解度为多少？,解：先由实验结果求得盐析常数：Lg蛋白质的溶解度=9.329-3.3（NH4）2SO4 因此，在3.0 mol/L（NH4）2SO4溶液中,蛋白质的溶解度=0.27g/L,盐析法,方法:A、“Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的。B、“”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。C、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法。,常用的中性盐中最重要的是（NH4)2SO4，溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也常在低温下（04）进行。几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）0 20 80 100（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101,分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析，一步就可以除去75的杂蛋白，纯度提高了四倍。不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用23mol/L浓 度 的（NH4)2SO4保存可达数年之久。价格便宜。,(NH4)2SO4缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，终产物必须除尽。次常用Na2SO4 缺点：在40以下溶解度较低，主要用于热稳定蛋白。,盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，避免局部硫酸铵浓度过大而造成蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。加固体（工业）、饱和溶液（小规模）,各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可查出。25 饱和浓度4.1mol/l(767g/l)100%饱和度 X=G(P2-P1)/(1-AP2)X:g/L G:0 515 20 513 A:0 0.27 20 0.29 P1、P2:初始、最终饱和度%,饱和溶液体积 Va=Vo(P2-P1)/(1-P2)Vo：蛋白溶液原始体积L,不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：,血清,球蛋白,清蛋白,(NH4)2SO4,50%饱和度,饱和,析出,析出,分段盐析,盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。蛋白质量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫酸铵饱和度,影响因素,无机盐种类In 1888，Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。阴离子排序为：柠檬酸根3-酒石酸根3-F-IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO-Cl-ClO-3 Br-NO-3 ClO-4 I-CNS-;对阳离子排序为：Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+,无机盐加入量配制一系列不同硫酸铵饱和度的蛋白质溶液，离心除蛋白，测定上清液蛋白浓度。,无机盐添加方式,连续（需盐量多）,蛋白质浓度 高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于25 mg/mL30mg/mL。,要将盐析分布曲线重叠的两个蛋白质分级沉淀：稀释后可能分级。,温度T,在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加。高盐常相反 一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力丧失。,溶液pH,pH影响Cohnx方程中的值。在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。,如从酵母中提取细胞色素C：离子交换后，洗脱液加85%(NH4)2SO4，产生杂蛋白沉淀，除杂蛋白，上清液调，产生细胞色素C沉淀。,盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析法。,透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去。,透析袋,蛋白质溶液,蒸馏水,有机溶剂沉淀法 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：降低水的介电常数，使蛋白质分子水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。,优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，可透析，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂。,缺点：,A、耗用大量溶剂，试剂易燃，有毒B、对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。C、收率也比盐析法低；,有机溶剂的种类：,乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀pro。,有机溶剂浓度的计算,可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。,影响因素及控制,温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。,一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控制在-10C下进行。一般蛋白质0，有机溶剂-10加入。但淀粉酶10-15。,有机溶剂浓度,同盐析一样，随着有机溶剂浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降。,如血纤维蛋白原的溶解度在乙醇浓度为8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时达到最小。,pH值：,通常是选在等电点附近，也考虑样品稳定性。很多酶pI在pH4-5，比稳定的pH低。,样品浓度：,避免使用很稀的浓度。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。,无机盐的离子强度,通常盐浓度以不超过5为宜，乙醇的量以不超过原蛋白质水溶液的倍体积为宜。少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果。通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。,金属离子 Ca2+、Zn2+等与蛋白形成复合物，降低溶解度。常用醋酸锌、硫酸锌。,沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，可以透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。,等电点沉淀法 利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。,由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。此法主要用于去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。,等电点沉淀,pH=pI 净电荷为零,溶解度最小 沉淀,等电点沉淀法,pI值通常在pH46范围内变化，一般用无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸）作沉淀剂。缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性。,等电点沉淀 四环素pI5.4 除杂：胰岛素pH8.0除碱性杂蛋白，pH3.0除 酸性杂蛋白 提取酶，pH5.0除核蛋白,选择性变性沉淀法 利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等变性沉淀而得到分离提纯。,热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。,表面活性剂和有机溶剂变性 使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀，通常在冰浴中进行。,选择性酸碱变性 利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。,有机聚合物沉淀法 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和葡聚糖等。,聚乙二醇,【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n 4)】(Polyethylene Glycol 简写为 PEG)。亲水性，溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛的分子量。在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为600020000的 PEG。,有机聚合物沉淀,优点：,A、体系的温度只需控制在室温；B、沉淀的颗粒往往比较大，产物比较容易收集；C、PEG非但不会使pro变性,而且可以提高它的稳定性；D、PEG无毒。,缺点：A、PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，需用超滤和液-液萃取来解决；B、价格较昂贵。,金属离子沉淀 与羧基、含氮、含氮杂环结合:Mn2+Fe2+Zn2+Cu2+与羧基结合：Ca2+Ba2+Mg2+Pb2+与巯基结合：Hg2+Ag+Pb2+,沉淀物分解除去金属离子 如锌盐沉淀胰岛素，CaCO3沉淀乳酸、柠檬酸，锰盐沉淀核酸 缺点：易使变性、复合物分解困难,Applications,早在50多年前，Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇来完成蛋白质沉淀经典实验的。应用低温乙醇分级沉淀人血浆的办法制备了白蛋白溶液，并通过冷冻干燥将乙醇从成品中去除，所得产品成功地救治了1941年珍珠港空袭后的幸存者。免疫球蛋白、血纤维蛋白原等其他许多蛋白质都是利用上述方法进行沉淀的。,结晶,溶质自动从过饱和溶液中析出形成新相 结晶状（纯度90%）无定形粉末一、结晶过程实质 一定T 溶液浓度溶质溶解度=过饱和程度S=C/C*C过饱和浓度 C*饱和浓度 前提；过饱和 动力：过饱和度,S-S 饱和溶解度曲线 恒定T-T过饱和溶解度曲线 变动 搅拌、晶种、冷却速度有关稳定区：任一点稳定亚稳区：加晶种浓度 工业不稳区：自发结晶、晶体细小,二、过饱和溶液的形成冷却法 适于溶解度随温度显著下降 分自然冷却、间壁冷却、直接接触冷却蒸发法 适于溶解度随温度变化不大 耗能多不常用真空蒸发冷却 化学反应结晶 加反应剂或调PH 四环素 调PI 头孢菌素C加醋酸钾 利福霉素S的BA加NaOH,盐析法 盐析剂：NaCl(NH4)2SO4 Na2SO4 甲醇 乙醇 丙酮 氨气 稀释剂：溶质在新溶剂中不溶或溶解度小 与原来溶剂互溶 甲醇 乙醇 丙酮 硫酸卡那霉素加60-70%（V/V）95%乙醇 加晶种 30-35,三、晶核形成和晶体生长晶核形成 过饱和溶液：溶质分子（离子）聚集析出晶核 结晶 分子运动减慢 放能 新相形成 耗能 成核速度与过饱和度、温度、物质种类有关 粘度 分子从液相平衡 位置到晶核表面更难 无机盐 化合价不易成核 相同化合价 结晶水 不易成核 有机物 结构复杂 M成核慢 蔗糖,温度SN 加晶种 缓慢冷却养晶区晶种均匀长大 不加晶种 快速冷却不稳区大量细晶核,晶体生长 扩散学说：溶质扩散到表面 C-Ci 溶质长入晶面 表面化学反应 Ci-C*结晶热溶液 C 液相主体浓度 Ci 晶体表面浓度 C*饱和浓度 影响因素 杂质 搅拌：促进 温度：一定范围内升高 扩散 表面化学反应,四、提高晶体质量途径 晶体大小 溶液的过饱和度 晶核形成速度晶体生长速度 细小晶体 温度 快速冷却 细小 缓慢 粗大 低温得到较细晶体 普鲁卡因青霉素-10制备晶种 搅拌 强弱 普鲁卡因青霉素 3000-1000 r/min 晶种,晶体形状 影响因素：过饱和度、溶剂、杂质、结晶温度、PH、结晶方法 普鲁卡因青霉素水中方形 BA长棒形纯度 吸附母液杂质 重结晶结块 晶体表面溶解并重结晶 物理、化学原因 影响因素：形状（长柱粒 不均匀均匀）湿度、温度、压力、贮存时间重结晶,