化学毒物的一般毒性作用.ppt

第四章 一般毒性作用及其试验与评价方法,1 急性毒性作用 2 亚慢性和慢性毒性作用 3 蓄积毒性 4 局部毒性作用,1 急性毒性作用,一、急性毒性和急性毒性试验的目的二、急性毒性试验三、急性毒性分级,急性毒性作用,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,急性毒性(acute toxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。,急性毒性作用,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,目的测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度。并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。探求化学毒物急性毒性的剂量反应关系与中毒特征。为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考依据。研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。为毒理学机制研究提供线索。,急性毒性作用,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,急性毒性试验常用的毒性参数：LD50/LC50Zac（LD50/Limac）LD84/LD16(或LC84LC16)剂量反应曲线斜率,急性毒性作用,毒作用带,急性毒作用带（acute toxic effect zone,Zac）为半数致死剂量与急性阈剂量的比值，表示为：Zac=LD50/Limac Zac值小，说明化学物质从产生轻微损害到导致急性死亡的剂量范围窄，引起死亡的危险性大；反之，则说明引起死亡的危险性小。,二、急性毒性试验,(一)试验动物原则：急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。动物易于获得品系纯化价格较低和易于饲养等条件。,急性毒性作用,二、急性毒性试验,1试验动物的种属和品系最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。急性皮肤毒性试验可选用成年大、小鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大、小鼠。,急性毒性作用,二、急性毒性试验,试验动物的年龄和体重：急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗46kg。(小犬)同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20。,急性毒性作用,品 系周龄 Wistar SD雌性雄性雌性雄性 354565052 4919786101 5134134130150 6166187172206 7209233210262 8214297240318 923232525836510246370272399,大鼠体重与周龄的关系,小鼠体重与周龄的关系 品 系 周龄 昆明 BALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 01.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 15.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 27.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 313.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 421.35 22.6011.6012.4512.2012.5715.7519.00 527.90 33.2514.7516.1016.9018.1020.7522.58 632.80 39.2515.6017.4018.4020.5021.8825.96 734.70 39.9016.1018.6519.0021.6023.1227.96 834.80 40.0518.1620.2520.2522.4024.1628.83,二、急性毒性试验,3.试验动物的性别：急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。,急性毒性作用,二、急性毒性试验,4.动物数量与随机分组：大、小鼠等小动物 每组10只，兔每组8只狗等大动物 每组6只分组原则随机化原则一般要求设5-7组5.禁食：经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食大鼠、小鼠隔夜进食；染毒后禁食4h大动物每日上午喂食前染毒染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水。6.实验动物的预检：选择健康动物12周的检疫期,急性毒性作用,二、急性毒性试验,（二）试验动物的饲养环境恒定的温度：223湿度：3070%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格,急性毒性作用,二、急性毒性试验,（三）染毒途径的选择:染毒途径（exposure routes）的选择需考虑：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。,急性毒性作用,对同一个毒理学试验应该用同一种、同一批号受试物 受试物成分和配方必须固定 如是异构体混合物，异构体比例必须固定 活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度也 应固定 受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性 必须进行研究并报告 受试物应一次备齐全部实验的用量,受试样品,二、急性毒性试验,经口(胃肠道)接触:灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g 大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只 家兔不超过10ml/2kg 狗不超过50ml/10kg 吞咽胶囊:经呼吸道接触:静式吸入 动式吸入 经皮肤接触:注射途径接触:,急性毒性作用,二、急性毒性试验,（四）染毒剂量与分组:1查阅文献了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍氏法等。找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。,急性毒性作用,二、急性毒性试验,2预试验 设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。根据确定的剂量组进行染毒。根据预试验的死亡资料确定组距。可根据以下公式计算出剂量分组：i=(lgLD90-lgLD10)(n-1)或：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1)式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数。,急性毒性作用,组距(对数)或 式中：n-设计的剂量组数,二、急性毒性试验,3正式试验 一般来说，根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如几率单位法、寇氏法一般设610个剂量组；霍氏法固定设4个剂量组。求得i值后以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。1 2 3 4 5 LgLD0 LgLD0+i LgLD0+2i LgLD0+3i LgLD0+4i 另一种方法：算出公比 r,急性毒性作用,二、急性毒性试验,（五）试验周期与毒效应观察1.中毒症状,急性毒性作用,二、急性毒性试验,2.体重在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多：若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。若化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。因此，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物应在观察期14天内称量其体重的变化以便了解受试物引起毒效应的持续时间。,急性毒性作用,二、急性毒性试验,3.病理检查及其他指标:急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。观察期结束后对存活动物进行大体病理检查必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目。如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。,急性毒性作用,二、急性毒性试验,4.死亡和死亡时间重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。对分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深入研究化学物的毒作用机制提供参考。,急性毒性作用,LD50的测定与计算,二、急性毒性试验,(六)经典急性毒性试验的局限性1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。,急性毒性作用,三、急性毒性的分级与评价,急性毒性作用,急性毒性作用,一 亚慢性毒性作用：亚慢性毒性的概念 亚慢性毒性试验的目的 亚慢性毒性试验的设计 二 慢性毒性作用：慢性毒性的概念 慢性毒性试验的目的 慢性毒性试验设计,2 亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性和慢性毒性试验,(一)概念：亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化合物所引起的毒性效应。慢性毒性(chronic toxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。,亚慢性和慢性毒性试验,一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的,（二）试验目的：1.确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱，对在急性及亚急性毒性试验中发现的毒作用提供新的信息，并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用；2.研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；3.研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值；4.研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性；5.亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据；6.确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。,亚慢性和慢性毒性试验,一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（一）实验动物选择,亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性毒性试验 年龄：大鼠80100g 狗 812月 小鼠1015g数量：小动物20 大动物6性别：雌雄各半,慢性毒性试验年龄：大鼠 5070g 狗 8月 小鼠 初断乳数量：小动物40 大动物8性别：雌雄各半,（二）实验动物染毒期限：工业毒理学 36个月食品毒理学 6个月1年环境毒理学 6个月1年致癌试验 接近或等于动物的预期寿命,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,经消化道经呼吸道经皮肤,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（三）实验动物染毒方式,亚慢性毒性的剂量选择阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组 急性毒性的阈剂量 1/201/5 LD50组距：310倍，最低不小于2倍,慢性毒性的剂量选择阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组 亚慢性阈剂量或其1/51/2 1/10 LD50组距：25倍，最低不小于2倍,（四）试验分组和剂量设计,亚慢性和慢性毒性试验,（五）观察指标,亚慢性和慢性毒性试验,1.一般综合性观察指标：外观体征、行为活动、体重、食物利用率2.一般化验指标：血常规；尿液检查；SGPT SGOT等3.系统尸解和病理学检查：（1）脏器湿重、脏器系数（脏/体比值）（如肝/体比，即(全肝湿重/体重)100）（2）病理学检查4.特异性指标：,亚慢性和慢性毒性试验,（五）观察指标,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,一、基本概念二、蓄积毒性试验方法及其评价,蓄积作用及其评价,3 蓄积毒性,化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。,蓄积作用及其评价,一、基本概念,蓄积性毒性作用的分类：物质蓄积(material accumulation)机体少量反复多次接触毒物，其量逐渐积累，可分析检测出该物质的增加过程，量随时间延长而增加，直至中毒阈值产生毒作用 功能蓄积(functional accumulation)机体少量反复多次接触毒物，每次引起的功能损伤逐渐积累，当积累到一定程度时出现毒性效应，而检测手段却查不出体内的毒物的存在或增加。,蓄积作用及其评价,一、基本概念,二、蓄积毒性试验方法及其评价,化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。,蓄积作用及其评价,(一)蓄积系数法 蓄积系数(accumulation coefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量ED50(1)的比值，即：KED50(n)/ED50(1)KLD50(n)/LD50(1),蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,1固定剂量法：一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出LD50，然后选取相同条件的40只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。试验组在120l50LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量LD50(n)，根据公式计算K值，然后依表65进行评价。但若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,2剂量递增法：,在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD50，即K5。使用本方法时要注意染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物的染毒绝对量。,蓄积作用及其评价,3剂量固定的20天蓄积法：它通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20 LD50、l/10 LD50、1/5 LD50和1/2 LD50四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。试验结束时根据下列标准进行评定：各剂量组均无死亡，即为蓄积性不明显；如仅1/2LD50剂量组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性；如1/20LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积性；如1/20LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,(二)生物半减期法：生物半减期(biological half-life，t1/2)法是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位时间内吸收该物质的速度以及清除速度有关。即使化学毒物以相等的时间间距恒速地吸收入血液，该物质在一定剂量范围内在机体的蓄积量也不呈直线无限地增加，而是呈曲线形上升并有一定的极限。这是因为化学物质吸收进入机体的同时体内也发生着代谢转化及清除的过程(包括血中化学毒物向组织脏器的分配过程)。当化学毒物的吸收过程与代谢转化清除的过程达到平衡时，其蓄积量基本上不再增加。一般来说，t1/2d较短的化学毒物达到蓄积极限所需的时间也短，t1/2长者达到蓄积极限的时间也长。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,四、局部毒作用,1.皮肤原发性刺激试验2.皮肤致敏反应试验3.光致敏反应4.光刺激试验5.眼刺激试验6.其他粘膜刺激试验7.替代（体外）试验,局部作用,