多重不对称扩增介绍.ppt
多重不对称PCR,黄桃生（生物芯片组）,多重不对称PCR,多重PCR(Multiplex PCR)不对称PCR（Asymmetric PCR）获得大量不同片段的单链DNA（SSDNA）,多重PCR,又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.1、扩增单一基因中多个片段（华法林检测）2、扩增不同基因中多个片段（HPV分型）,多重PCR技术优点,高效性：在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体。系统性：多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌等同时检测。经济简便性：多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。,多重PCR技术难点,反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同.难点主要体现在前期引物设计过程中反应体系的平衡,反应体系不平衡,反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂（SantaLucia,2007）。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制住了，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加举步维艰，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。正所谓强者更强、弱者更弱。导致不平衡的原因：1、引物特异性；2、最佳退火温度不一致；3、引物二聚体；4、模板量不同；5、引物扩增效率,引物特异性,如果引物与体系中其他非目的基因片段结合能力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竞争，从而导致扩增效率下降。严格blast验证,最佳退火温度不一致,将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。前期引物设计时减少最佳退火温度的差异，最佳退火温度的差异不超过35为宜。,引物二聚体,包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的二聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竞争，影响扩增效率。针对不同对引物之间二聚体，目前可以采用Visual OMP6软件（7天试用版）进行验证。,引物扩增效率,这个因素很重要，但也很笼统，它也许包含了上面提到的几个因素，但更多的因素还不清楚。引物的扩增效率到目前为止，还没有一个可以明确的定量计算方法。目前也有文章提出使用统计学方法，利用qPCR的数据建立一个模型，来预测引物与目标序列的扩增效率。http:/srvgen.upct.es/efficiency.html,不对称PCR,用不等量的一对引物进行模板的扩增，PCR扩增后产生大量的单链DNA。这对引物分别称为非限制性引物和限制性引物。在扩增过程前10-20个循环，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗殆尽，不再引导扩增，而非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR会继续进行，从而就会产生大量的单链DNA。,不对称PCR优缺点,优点,可以获得大量SSDNA，快速进行下游操作。比如直接进行测序，或者下游杂交检测无需经过变性这一步骤。,缺点,前期10-20循环相当于对称扩增，单链DNA在此之后才会出现，从而导致PCR扩增循环数增加，灵敏度较对称性扩增低。不对称扩增对于低拷贝样本的扩增较难，对于病原体检测需要更详尽的PCR设计和优化。,不对称PCR设计,设计不对称PCR引物时，限制性引物的Tm值较非限制性引物Tm值高46，扩增效果更佳。不对称PCR设计在于控制限制性引物（低浓度引物）的绝对量，限制性引物过多或过少，均不利于SSDNA的制备。限制性引物量可以考虑设置在0.8-1.5P之间。设置限制性引物量后，再通过实验验证限制性引物浓度和非限制性引物浓度的比例，目前常用比例1:3、1:5、1:10、1:15、1:20进行优化，一般情况下，1:10、1:20比例情况下效果可能更佳。,增加单链的方法,1、纳米金微粒介导不对称扩增 纳米金颗粒可以增强PCR扩增效率和特异性，有可能是由于金纳米颗粒与单链引物之间特异性结合，类似单链结合蛋白SSB功能，一直PCR非特异性扩增，更重要的可能是，金纳米颗粒的热效率和热传导，在液相中，纳米颗粒可以快速传递热量并且与周围环境在10200ps内形成热平衡，增强扩增效率。通过金纳米颗粒介导进行的不对称PCR，可以获得与普通不对称PCR更好的效果。2、LATE-PCR(Linear-After-The-Exponential PCR),多重不对称PCR重要影响因素,引物二聚体引物特异性 主要是导致不对称PCR限制性引物和非限制性引物比例的改变，或者限制性引物绝对量的改变，从而导致扩增差异化或者扩增失败。,多重不对称PCR设计软件,PrimerPlex（付费）一款设计特征寡核苷酸片断、用于同时分析100种核酸序列的工具。Mpprimer（开放、在线）最多一次可以设计6对引物、基于PP3内核。PP5/Oligo 6+OMP 6（目前芯片组设计多重不对称扩增采用的软件）,多重不对称PCR步骤,引物设计（PP5/OLIGO6),BLAST验证引物特异性,OMP软件验证引物二聚体评价,每对引物进行单扩并验证不对称扩增引物最佳比例,将所有引物并入一贯体系进行实验验证,选出出现问题的引物进行重新设计,谢谢,
