分子生物学(余爱丽)第八章prok基因表达调控.ppt

第8章 Prok 基因表达的调控,第一节 相关概念及操纵元调控花式概述第二节 乳糖操纵元（Lac Operon）第三节 Trp Operon及弱化作用机理第四节 基因转录的时序调控第五节 Prok.翻译水平的调控第六节 DNA序列重排对基因转录的调控,第一节 相关概念及 操纵元概述,代谢调控过程是自身生存和繁衍所必须,Prok.和Euk.都有各自准确调节基因表达的机制,基因表达(gene expression):,基因表达调控(gene regulation or gene control):任何影响基因转录过程和翻译过程的开启、关闭和这两个过程速率的较为直接的因素及其作用,涉及：RNA转录的开/关，数量，选择性加工 蛋白质翻译速率，数量，加工与 降解和分泌,Prok.和Euk.的调控极其相似,调控机制：核酸分子间的互作,核酸与蛋白质分子间的互作,蛋白分子间的互作,调控层次：DNA水平的调控 转录水平上的调控,转录后水平的调控（mRNA加工成熟水平上的调控）,翻译水平上的调控,翻译后水平的调控,共同的起源与共同的分子基础,转录水平上的调控是最为经济,灵活，又是最为重要，复杂的调控,a、在复杂的基因组内，确定需要基因转录的起始位点,b、精细调节基因表达的水平,以保证生物体对环境的适应,c、cis factor&trans factor 间严格而又灵活的互作,d、保证RNA polymerase 的进行式转录（不中断，准确终止）,生物遗传信息的概念,Genome DNA,遗传信息的两大类别,II类；特定DNA seq.+特定蛋白质/核酸结合,内在信息 内,外(信号分子)结合信息,ORF only Helix,Nt seq.,遗传信息存在于模版链 三维空间结构/DNA序列 的一级结构上(IR,Box,paracodon),三联体密码 空间，调控密码(钥匙与锁),简并 简并,摇摆同工受体,遗传信息表达的方式（Euk.）,组成型表达（constitutive expression）,Housekeeping gene,诱导型表达（inducible expression by signaling molecular）,Luxury gene,顺、反因子间互作方式的基因表达调控,顺式作用元件（cis-acting element）:对基因表达有调节活性的DNA序列，只影响与其同处一个DNA分子或物理 上相连的DNA上的基因,反式作用因子（trans-acting factor）:与顺式作用元件相互作用影响基因表达 的蛋白因子，其编码基因与其识别或结 合的靶核苷酸序列不一定在同一个 DNA分子上,操纵元(Operon):Prok.中,基因表达调控的一个完整单 元,包括结构基因和控制区(O、P)以及调节基因 的整个核苷酸序列,操纵元中各结构基因按一定比例协调翻译,具有极性突变效应：操纵元中一个近基因的无义突变能够影响远基因表达，且根据距离远近呈极性梯度效应,P、O紧密连锁或彼此重叠，I基因位点不固定（顺式作用元件、反式作用因子）,正调控系统:没有调节蛋白存在时，结构基因是关闭 的，而加入有活性的调节蛋白后,结构基 因的表达活性被开启,无辅基诱导物或激活物,负控制系统:没有调节蛋白存在时，结构基因是开启的，加入这种有活性的调节蛋白后，结构基因表 达活性被关闭,阻遏蛋白,所谓“关闭”指表达水平很低 本底水平的基因表达(12个mRNA分子细胞周期),“开启”也常有程度的差异,操纵元的调控体系,负调控系统 正调控系统,诱导 阻遏,基因表达调控的分子机制,1、调控蛋白质的对称性与其识别序列的对称性,调控蛋白都是同种分子的多聚体二聚体、四聚体,二倍旋转对称,通过单体和多聚体间的平衡迅速作用,于特异识别位点之 间提高调控作用的 特异性（反向重复 序列）,in major groove,特异和非特异结合力,2、调控蛋白的DNA结合结构域的主要花式,主要有：螺旋-转角-螺旋（HTH）Cys-Cys锌指 Cys-His锌指,调控蛋白上存在与DNA和其它蛋白质相互作用的位点,螺旋-转角-螺旋,*两个螺旋被一个转角隔开*一个螺旋起识别结合DNA的作用,3个helix,H1与H2平行 H2与H3形成HTH motif H3位于大沟中，与DNA特异结合,C蛋白N端有五个螺旋,螺旋2和3与DNA相互作用,C端负责二聚体形成N端负责与DNA接触,锌指结构 概念:与DNA结合的蛋白质中一小组保守AA与一个Zn2+结 合起来形成蛋白质中一个相对独立的结构域,按结合的AA不同有两种类型,a、Cys-His(C2/H2)锌指 经典的锌指蛋白,中部芳香族氨基酸保守，加上Zn和Cys和His之间的配位结构形成疏水核,经典的锌指蛋白、类固醇受体（激素）,不同锌指蛋白中锌指数目多少不等,锌指可以串联重复排列，两指间7-8aa,TFA 有9个锌指、通用转录因子SP1有三个,经典锌指的三维结构：一个折叠和一个螺旋,锌指上的螺旋负责与DNA作用,b、Cys-Cys(C2/C2)锌指 类固醇受体,Zn与4个Cys残基形成配位键,Cys,Cys,糖皮质激素受体,ZYJ272,3、调控蛋白与蛋白质结合的方式,（1）HLH 结构特点：长4050个AA残基中含有两个既亲水有亲 酯的螺旋,被不同长度的连接区隔开(环),此类蛋白借助两个螺旋对应面上疏水基团的相互作用形成 二聚体(同种或不同种亚基),鉴定的较清楚的 蛋白质与蛋白质相互作用的结构基元有,螺旋-环-螺旋（HLH）Leu拉链,HLH基元附近有个高度碱性的区段为结合DAN所必须bHLH,（2）Leu拉链,蛋白上含有4或5个精确的相距7个AA的Leu残基,概念：调控蛋白上富含亮氨酸残基的结构域参与形成二聚体,Leu出现在-螺旋疏水的一侧，并直线排列,于是，两个蛋白分子的两个螺旋之间依赖Leu残基之间的疏水作用形成一条拉链,Leu拉链区的氨基端约30个残基的碱性区与DNA结合,Leu拉链作用形成Y型结构，拉链为茎、碱性区分叉对称成臂拉链蛋白的目标DNA为没有间隔的反向重复,第二节 乳糖操纵元,一、乳糖操纵元,1961 Jacob&Monod（法国）,1、结构:,2、调节基因 I,产物为阻遏蛋白,四聚体为活性形式,转录方式为组成型转录,LacI的表达效率很低,原因其启动子与RNApol的亲和性很低,阻遏蛋白有两个结合位点:操作子位点、诱导物位点,二、Lac Operon的负调控,1、细胞内无诱导物时,呈阻遏状态,阻遏蛋白和操作子的结合,影响了RNApol在-10序列上 形成开放型的启动子复合物,2、细胞内有诱导物时,呈诱导状态,诱导物与阻遏蛋白迅速结合而改变其构象从O上解离RNApol,3、诱导物,异乳糖(allolactose),乳糖进入细胞后，由-半乳糖苷酶催化产生,-半乳糖苷酶来源于乳糖操纵元的本底组成型合成,RNApol利用LacO处于游离状态的瞬间进行转录(阻遏蛋白与LacO有10min20min的结合半衰期),一个mRNA细胞周期,安慰诱导物（义务诱导物）可诱导半乳糖苷酶产生但不是其底物,*IPTG，异丙基-D硫代半乳糖苷,*TMG，巯甲基半乳糖苷,*ONPG，O-硝基半乳糖苷,4、阻遏蛋白与操作子的相互作用（硝酸纤维素膜结合试验）IPTG LacOC,IR序列以+11为对称轴两边为两段各6bp的重复序列,11,+5到+17之间,大部分在左侧,操作子的结构,Lac Repressor=tetramer,三、Lac Opreon的正调控CAP-cAMP复合物,cAMP,CAP蛋白,cAMP,Low glucose=high cAMP,总结,lac operon transcription-control region,第三节 Trp Operon及 弱化作用机理,一、结构,结构基因,末端-终止子trpt(依赖)、trpt(不依赖),相距很远的trpR编码阻遏蛋白 其活性形式为四聚体,并且只有结合trp时才有活性,控制区域:P、O和前导区及弱化子,trpO与trpE之间的162bp的前导区可转录到mRNA中,trpO的结构,*位于trpP内，20bp,有完美的IR序列,*trpP有正常的35和10区，10区完全在trpO内,二、阻遏调控机制,无trp时,有trp时,无活性,弱化作用控制-基因转录的翻译调控,通过核糖体对前导区的翻译而对转录进行调控,弱化子（attenuator):Trp Operon中trpE前的一段 非结构基因的对应序列（123150），其中 包括不依赖因子的终止子，由于翻译的作用使 转录终止，这段序列称为(衰减子),发现缺失增加结构基因的表达，且与阻遏蛋白无关,弱化子调控的表现：（与阻遏蛋白的负调控结果类似）,*无trp时，所有RNApol都能通过弱化子,*有trp时，部分逃过阻遏蛋白监督的RNApol在弱化子 处大部分被扣留，而只有10能通过,1、Trp Operon mRNA的前导序列结构,下游-14aa的前导肽的ORF，其中两个相连的trp的 codonUGG(60位)对弱化作用的实现起重要作用,下游长28bp的不依赖因子的终止子为弱化子的核心部分,前面有核糖体结合位点（SD序列）,2、前导序列的二级结构 决定RNApol在弱化子处是终止转录还是继续转录,1和2、3和4配对,序列1和2、3和4配对时，RNApol在3、4区的不依赖因 子的终止子处终止,其后的trpE等基因表达受到限制（翻译作用不存在时或顺利进行）,2和3配对,序列2和3配对时，RNApol继 续转录，使前导序列后的结构 基因得以转录,3、弱化子弱化控制的机制 Prok.无核膜，转录和翻译偶联（1）细胞缺少trp，Trp-tRNATrp水 平低，核糖体停顿在两个邻 近的Trp密码子处，此时核 糖体占据序列1，此时序列4 还没转录出来，序列2和3有 机会配对，RNApol可通过弱化子,(3)此外,Arg饥饿时有相同的后果,(2)当细胞有Trp时,Trp-tRNATrp水平很高,核糖体顺利地翻 译出前导肽而在终止密码子处(+70,UGA位于序列1和2之 间)解离,此时,核糖体占据了序列1和部分序列2,使序列2不 能有效地和序列3配对,因而序列3和4产生终止子发夹结 构,转录终止,实现弱化子对转录的调控关键是时间和空间上的巧妙安排,空间上：两个Trp的codon位置至关重要,时间上：核糖体停顿在两个Trp codon上时，序列4还没 转录出来，否则,这种巧妙安排的一个原因就是RNApol在转录完+90序列处时产生一次延宕给与核糖体以追赶的机会,5、Prok.中弱化子（衰减子）的普遍性,许多负责氨基酸合成的operon都受弱化子的控制，尤其是His operon中，弱化子是唯一的调控机制,第四节 基因转录的时序调控,时序调控:Prok.在生长发育的各个阶段，基因的表达是按照 一定的时间顺序而展开的,如:噬菌体的复制和颗粒的包装,*有效利用能源避免浪费,*避免了某些基因表达时机不当所带来的危害,是多种蛋白质与RNApol作用的结果,一、枯草杆菌中亚基的替换,1、枯草杆菌中phageSPO1早、中、晚期基因表达的转换,早期基因-寄主的RNApol全酶55,早期基因28编码的gp28取代55,含有gp28的全酶转录中期基因,中期基因33、34编码的gp33、gp34取代gp28,以gp33gp34为亚基的全酶转录晚期基因,2、枯草杆菌孢子形成过程中亚基的替换,二、phage裂解性生长和溶源状态的调控,phage进入寄主体内后环化,其中,裂解周期-环形分子 大部分基因表达,溶源状态-以线性分 子形式整合到寄主的 染色体上,使大部分基 因不表达,Phage的操纵元组织情况,(一)phage裂解生长过程中的基因表达,进入寄主cell的phage 的DNA上没有任何调节蛋白，因此寄主的RNApol便结合于PL和PR,1、抗终止蛋白PN和调节蛋白Cro首先被转录,2、PN蛋白的作用导致PL和PR控制的迟早期基因的表达 表达产物C蛋白、C蛋白、O蛋白、P蛋白、Q蛋白,3、PQ蛋白的作用导致PR 控制的晚期基因的表达 表达产物头尾蛋白、溶菌酶蛋白,（二）溶源途径,巧妙的调控，小区段表达，整合到寄主染色体上,*此外，C促进Pint启动子转录，使int gene表达产生 整合酶,1、溶源化的建立PE启动子的转录,*C、C蛋白共同确立PE处C的转录（左向）PE(Establisment Promoter),*C阻遏与裂解生长有关基因的转录，其中转录出的 CmRNA含有S-D序列，因此有很高的翻译活性,N蛋白和Cro蛋白被转录,N蛋白抗终止C、C蛋白被转录,C作用于PE(PRE)转录C,阻遏蛋白结合于OROLC导致自身从PRM处转录,C、C蛋白是C合成的正调控因子，作用于PE 处，C是关键,Cro蛋白间接抑制C、C的转录，直接阻止C的转录,2、溶源化的维持PM启动子的转录,已产生的整合酶使整合并实现溶源化（attp、attB）,溶源化的维持需要低水平的C转录，保持自身阻遏循 环，这个功能由PM完成,C蛋白对PM正调控，但PM起始转录的C没有S-D 序列，因此翻译效率很低，但足以维持溶源状态,溶源状态的维持通过C蛋白结合于OL、OR上而实现,溶源周期,3、C、C蛋白对C和Cro的影响,C和Cro是phage的两种调节蛋白，其中Cro能关闭C的表达,溶源化状态的进入与否靠二者结合操作子的情况决定，数量是谁占上风的关键,二者与操作子的亲和次序为,C蛋白 OL1OL2OL3 OR1OR2OR3,Cro蛋白 OL3OL2OL1 OR3OR2OR1,结合的结果阻止PL和PR的转录,C、C蛋白是C和Cro蛋白谁占上风的关键,因为在C、C的帮助下C表达 而Cro蛋白远早于C蛋白的表达,OL1和OR1分别与PL和PR重叠,即-C阻遏二启动子的能力强,正常情况下，寄主的hfl基因产物大量存在导致Cro占上风 因为hfl编码一种蛋白酶水解C,此时Cro蛋白对左右两个早期操作子亲和力的差异，使两 个操纵元初期表达一段时间才关闭,因此产生足够的O、P蛋白（复制有关）和PQ，从而使菌,4、导致溶源化的因素,（1）营养耗竭：寄主能源濒临枯竭时，导致cAMP产生等 一系列生理变化*cAMP对hfl基因负调控，使分解C蛋白的酶大大 减少，C又能抑制该酶，因而C、CC,体走向裂解,（2）MOI值过高（10）：MOI指感染时噬菌体与 细菌的比例，称感染复数*C蛋白其作用的形式是寡聚体形式，单体不稳 定无活性,*一两个噬菌体感染寄主时，产生的C不足以形成 寡聚体,*MOI值过高时，足够C寡聚体产生，确立从PE 转录C，CmRNA的高翻译活性导致C数量 占上风，PE活跃转录的同时抑制了Cro基因的表达,*由于C和操作子亲和力情况，导致C、C不再 表达，但由于C对PM的正调控，产生能够维持溶 源状态数量的C,5、溶原状态溶菌状态溶原菌受到紫外线等作用细胞中recA蛋白获得蛋白酶活性，水解阻遏蛋白 RNA聚合酶与两个早期操纵元的启动子结合，转录翻译出N和Cro蛋白 迟早期基因O P Q蛋白表达 晚期基因表达,第五节 翻译水平的调控,翻译的调控主要发生在翻译的起始阶段，基因表达时翻译 的效率主要取决于mRNA的一级结构和高级结构,因此，mRNA的翻译起始区域往往是调控的靶位点（结构状态）,一、反义RNA的调控作用,反义RNA：又称干扰 mRNA 的互补 RNA，简称 micRNA（mRNA-interfering complementary RNA）指与靶 mRNA具有互补序列的调控RNA，通过互补 的RNA序列与特定靶 mRNA结合，起负调控作用,属于核酸与核酸的相互作用,作用机理,例如：1985 Hoopes等人发现的噬菌体 C抑制晚期基因的 转录就是通过micRNA起作用,Q基因有一个依赖于C的启动子PaQ（抗Q），其转录方向与Q基因相反，即转录产物RNA与Q基因的5端的一半完全互补，从而抑制Q基因的翻译，抑制晚期基因的表达,转录产生反义RNA的基因称为反义基因,结合位点：mRNA的SD序列、起始密码子、氨基酸N端的 部分密码子结合,二、mRNA本身的二级结构影响翻译的进行,三、蛋白质合成的自体调控,*有些蛋白质能够直接控制自身mRNA的可翻译性,*核酸结合蛋白或者是与核酸分子相互作用为其生理功 能的蛋白质,*即这些蛋白质的mRNA上可能也有其结合位点,1、释放因子RF2合成的自体调控 利用自身释放肽链的职能提前终止其mRNA的翻译,*当细胞内RF2供应充足时，RF2促成核糖体在上述UGA处肽链 合成的终止,*若细胞缺乏RF2，则核糖体以未知机制向前滑动一个Nt，发生移框，继续合成到最后一个密码子,RF2蛋白质340个AA codons不处于同一阅读框,5.GUU CUU AGG GGG UAU CUUU GAC UAC GAC.3,NH2 Val Leu Arg Gly Tyr Leu Asp Tyr Asp COOH 20 21 22 23 24 25 26 27 28,2、核糖体蛋白合成的自体调控,*E.coli核糖体蛋白质的合成与rRNA（EF_Tu）合成严格协调（数目）,通过控制翻译的起点即控制核糖体与自身mRNA的结 合而对其自身蛋白质mRNA可翻译性进行控制,*核糖体蛋白质与RNApol各亚基及延伸因子等混合编组在不 同的操纵元中,*每个operon有一个核糖体蛋白质作为自身operon调节蛋白,*每个操纵元的mRNA上具有与调节蛋白的结合位点-靠近或包含SD序列,*操纵元 mRNA上与调节蛋白的结合位点与组装核糖体时 rRNA 上结合位点高度同源，具有相似的二级结构,L11/L1 opreon,*调节蛋白与 rRNA的结合力高于与自身 mRNA的结合力,*调控方式,当细胞内核糖体较少时，有游离的rRNA存在，调控蛋白优先结合rRNA，此时调控蛋白控制的自身操纵元mRNA继续翻译,相反情况，调控蛋白优先结合mRNA，此时调控蛋白控制的自身操纵元mRNA停止翻译,调控实质：核酸的合成水平调节了蛋白质的合成翻译水平调节,五、严谨反应调控（stringent response control）,基本概念：原核生物在不良的营养条件下（AA饥饿），自动停止或降低（1020倍）rRNA、tRNA 转录，从而调节蛋白质合成速度严谨现象,相关因子：严谨因子：焦磷酸转移酶 由relA基因编码 正常情况下很少表达,信号分子：魔斑（magic spot）:ppGpp 鸟苷5-3-二磷酸 魔斑（magic spot）:pppGpp 鸟苷5-三磷酸3-二磷酸,之所以称为魔斑-AA饥饿时，E.coli的薄层层析图 谱上有两种Nt与常见的Nt的迁移率不一样,调控机制 空转反应：AA饥饿时，无负载的tRNA进入核糖体的A 位后，新肽键不能形成，但GTP不断消耗 空转反应导致信号分子的产生 ppGpp pppGpp ppGpp可与RNApol作用，使其不易变构 pppGpp与转录I位点作用，阻止RNApol结合,从而抑制tRNA、rRNA转录,放慢转录起始、延伸过程，放慢蛋白质合成过程，启动AA合成基因，通过紧缩开支，渡过难关,基因表达翻译水平的调节,第六节 DNA序列重排对基因转录的调控,Prok.中研究最多的是鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛基因的相变 过程一、沙门氏菌的、相及基因分布,on,off,二、H2rh1转录单元的表达机制,*H2rh1转录单元的表达受其上游一段 995bpDNA 序列排列方向控制,*995bp 序列两端各有一段 14bp 的 IR IRR 982995 IRL 114,*H2 基因的起始密码子与 995bp 相隔 16bp，启动子 位于 995bp 序列末端,*995bp 序列中 hin 基因产物可催化 995bp 序列的倒位,P,P,P,P,非复制型原位转座,相变机制,三、相变的意义,逃脱寄主抗体的进攻,此外 Euk.的酵母结合型 免疫球蛋白的分子多样性,本 章 结 束！,复习题名词解释正（负）调控系统 基因表达调控 操纵元 反义RNA 弱化子 严谨反应 锌指结构 Leu拉链 RNA编辑,问答题1、简述Lac 操纵元负调控机制。2、说明乳糖操纵元诱导物及其最初如何产生？3、简述乳糖操纵元的正调控机制。4、说明乳糖操纵元在乳糖、葡萄糖有和无的四种组合情况下的 表达情况及根本原因。5、Trp操纵元弱化子系统如何调控基因表达。,6、简述噬菌体整合与切除的机制。7、说明反义RNA调控基因表达的原理。8、核糖体蛋白质如何实现自体调控？9、HLH和Leu拉链如何在调控蛋白的结合中起作用？10、鼠伤寒沙门氏菌鞭毛基因相变的简单机制。,Conclusion：,-body松弛,Euchromatin 的结构特点有利于基因的表达,3、沉寂匣子的表达,受阻遏蛋白亚基基因sir1、sir2、sir3、sir4的产物Sir蛋白的反式作用控制,Sir(silent information regulator)结合在HML和HMR的启动子上游,而MAT上无结合位点,