体外单倍体诱导与单倍体育种.ppt

体外单倍体诱导与单倍体育种,体外单倍体诱导通常是指利用离体培养花药或小孢子的方法，诱导形成单倍体植株。单倍体育种是指将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体，从中筛选出优良个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料1。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,花柄,花托,子房,花萼,花瓣,花柱,柱头,花药,花丝,雄蕊,雌蕊,（花冠）,花粉植株形态发生的方式,愈伤组织型：离体培养的花粉粒先形成愈伤组织，再分化为单倍体植株水稻花药的培养,接种在平板上的水稻花药,部分花药产生愈伤组织,类胚体型：离体培养的花粉粒分裂后，以胚状体的形式释放出来，然后发育成植物体,部分花药通过胚状体途径形成小植株,烟草花药培养,通过胚状体途径再生形成小植株,烟草花药培养,13.1 植物小孢子发育过程,第一期，小孢子母细胞减数分裂形成四分体。四分体的周围包裹着一层厚的胼胝质，随着胼胝质的分解四个小孢子便分离开来；第二期，单个小孢子继续发育。进行第一次花粉细胞有丝分裂，分裂是不对称的，这种类型的花粉粒称为A型；第三期，小孢子发育形成成熟的花粉粒。标志：细胞中明显出现两个核。,花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程2。（器官培养）花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养）,13.2 花药和花粉培养：,历史：,Guha和Maheshwari（1964）曼陀罗花药培养Nitsch 和 Norreel(1973)烟草花粉培养（游离小孢子培养）Chu（1973）小麦花粉培养（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等3。90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相继成功Konzak(1999)。,花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”4。两者的异同点培养目的相同，均获得小孢子植株。花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。,2.花药或花粉培养的意义：,2.1 作物育种（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。,例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法：AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开。,（2）提高了目标基因型的选择效率,ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb,例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法：AAbb出现的概率为1/4。,（2）提高了目标基因型的选择效率,植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。,（3）诱变育种中的作用,2.2 物种进化研究 可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。2.3 遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析5。2.4 构建连锁图谱 双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建2.5 用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受显隐性影响。,3.花粉孢子体发育途径（雄核发育）,3.1 花粉发育的阶段,花粉离体培养时，雄核发育最适宜的时期一般是第一次有丝分裂或之前。,3.2 雄核发育途径,1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体（2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体（3）A-VG途径（E途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株,1、雄核发育与P花粉的形成P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核发育与饥饿处理饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。,3.3 雄核发育启动机理,1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂6。,3.4 花粉植株形态发生方式,4 花药和花粉培养方法,4.1 花药培养,1、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。2、消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。3、培养 固体或液体培养基均可。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株7。,4.2 花粉培养,(一)花粉的分离与纯化 1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。3、机械游离（1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；（2）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子,梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）,30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）,(二)花粉培养方式 1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。4、看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。,看护培养图解,其操作方法是在固定培养基上置入一块活跃生长的愈伤组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转移至琼脂培养基上让其迅速生长。,一、倍性鉴定,1、染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。2、间接鉴定（1）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。（3）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实8。,4.3 单倍体植株鉴定和染色体加倍,（4）杂交鉴定法自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标记鉴定包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如RFLP、RAPD、AFLP等）,4.3 单倍体植株鉴定和染色体加倍,二、染色体加倍,（一）茎段培养将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。,4.3 单倍体植株鉴定和染色体加倍,二、染色体加倍,（二）化学试剂诱变有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1、秋水仙素诱导（1）浸泡法无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。（2）生长锥处理 秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。（3）培养基处理 将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。2、除草剂诱导（毒性小，引起植株的变异几率小）,4.3 单倍体植株鉴定和染色体加倍,花药和花粉培养基本流程：,5.影响雄核发育和花粉花药培养的因素,（一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一。同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大。如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻。,（二）供体植株生长条件和生理状态1、植株生长条件 光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。2、植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。3、P花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量,（三）花粉发育时期小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。,四分体:醋酸洋红染色,四分体:Alexanders 染色,单核期,双核期,成熟花粉粒,处于不同发育时期的烟草小孢子,单核晚期,液泡,第一次有丝分裂后期,双核早期,双核中期,生殖核,生殖核,营养核,（四）预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件 预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等9。,1、高低温处理低温预处理：指在接种之前将材料用0以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。处理温度一般在1-14，时间从几小时至几十天不等。不同作物所用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。例子:小麦穗子培养前4预处理几天，花药培养效率显著提高。十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降为10.47个10。,预处理方法：,2、化学物质处理,包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子去分化。,3、其它,包括射线、离心、磁场等。,（五）培养基,1.基本培养基 主要为N6和MS培养基。在此基础上发展出一些其它的培养基。如H培养基（适于烟草）、C17培养基（适于小麦）、马铃署-培养基（适于马铃署）,2.碳源 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。,3、激素4、氨基酸5、活性碳6、pH,（六）培养条件,1、温度 物种间有差异2、光照 3、植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。5103到2104ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。,03,02,01,缩短育种周期，加快育种进程,04,克服远缘杂交的不亲和性,提高诱变育种效率,合成育种新材料，丰富遗传资源,单倍体育种的优点,有利变异少，须大量处理材料,诱变的方向和性质不能控制,改良数量性状效果较差,单倍体育种的缺点,1,2,3,4,5,6,7,玉米单倍体育种技术,大麦单倍体育种技术,马铃薯双单倍体育种技术,茄子花药培养技术,烟草单倍体育种技术,水稻单倍体育种技术,甜（辣）椒花药培养技术,单倍体育种技术应用,玉米单倍体育种技术,利用单倍体技术可缩短培育优势杂种时间,克服远缘杂交产生的不亲合性、提高诱变育种的效率、合成玉米育种新材料。单倍体技术培育玉米自交系在美国正被玉米商业育种家广泛地利用。在我国,最早开展此项研究的中国科学院遗传研究所,通过采用孤雌生殖技术,在不到20年的时间里已育成3000多个孤雌生殖纯系,其中综合性状优良或个别性状突出,可直接或间接用于育种的近350个,选出多个优良组合参加省级和国家级区试。遗单6号、科玉10号、秦单5号已通过审定,并在生产上进行推广11。,获得玉米单倍体技术,1自然发生的单倍体 生殖过程异常所引起的孤雌或孤雄生殖而来的玉米单倍体,自然发生的单倍体的频率极低,仅为10-510-8。由于单倍体高度不育,其植株和它的组织器官等都比它们的二倍体弱小,所以自然界中存在的单倍体很少。2孤雌生殖 诱导玉米孤雌生殖的方法很多。利用异种花粉授粉,刺激未受精卵发育引起孤雌生殖产生单倍体；利用紫外线处理的玉米成熟花粉粒给正常植株授粉,让已无授精能力的花粉去刺激未受精的卵细胞单性发育成单倍体的胚；利用甲苯胺蓝等化学药剂处理花粉产生单倍体。化学药物诱导孤雌生殖常易产生一些影响生理生化和形态上的畸变,其可靠性常受到怀疑。,3花粉、花药培养 用花药、花粉组织培养技术获得单倍体。在获得单倍体的同时，还常常出现已自然加倍了的二倍体和双倍体。4传粉玉米子房诱导单倍体 利用花粉的生物刺激作用来诱导传粉的玉米子房产生单倍体植株,可建立起高效、稳定的玉米单倍体诱导体系。当授粉时间控制在1222h,授粉子房均有可能诱导出单倍体植株，春秋季诱导单倍体植株的效果比夏季好12。,5远缘杂交单亲染色体消失 在远缘杂交中,可能由于双亲体细胞分裂周期的不同步,导致某一亲本染色体的丢失,从而引起单倍体的发生。6辐射诱导 用射线照射花或父本花粉经X射线处理后,给去雄的母本授粉,以影响授精,诱导单性生殖产生单倍体。,7利用高频诱导单倍体材料 美国发现了一个高频诱导单倍体的材料并定名为Stock6,为早熟、白色、粉质、硬粒型的玉米,后又经过两次回交和两次自交导入了控制子粒性状和植株性状的两种显性标记基因。它具有两个标记性状:子粒有斑纹、成株叶片和叶鞘呈紫色,均是由互补基因控制。Stock6诱导产生单倍体的原理已经清楚,双授精过程中一个精子与极核结合,而另一个精子不能与卵结合形成授精卵。在育种实践中用作父本,被诱导的育种试材作母本,大约有3%的单倍体胚。此外还有A358、ZMS、MKS、MHI等一些单倍体诱导材料,均能够产生大约3%的单倍体胚。,玉米单倍体育种的前景,单倍体技术在玉米育种中的应用前景十分诱人。不仅具有理论意义，还存在着巨大的生产潜力。首先对目标诱导材料进行重组与改良，使其积累足够的有利基因位点，然后利用单倍体技术使优良的基因快速纯合，获得性状优良的纯系，这将会极大地发挥单倍体育种技术的优势，极大提高玉米育种的效率。未来的工作将以进一步完善单倍体诱导体系、提高单倍体诱导率和提高单倍体加倍技术为重点研究方向。另外单倍体育种技术可以和品种设计、分子育种、转基因技术等结合起来，使单倍体育种技术发挥更大作用。,单倍体育种研究的现状,单倍体育种的研究，确实是取得了很好的成绩。但是研究才刚刚开始，还有无数的难题依然令我们的专家束手无策。例如：单倍体植株无法正常结实、单倍体育种在生产中成本高等等问题，依然无法得到很好的解决。还有，就是单倍体育种只局限与植物，而不能应用于动物体身上。这也是有待解决的问题。,参考文献,1 才卓,徐国良,刘向辉等.玉米单倍体诱导选系研究J.玉米科学,2004,12(1):10-11.2 陈绍江,宋同明.利用高油分的花粉直感效应鉴别玉米单倍体J.作物学报,2003,29(4):587-590.3 杜娟,母秋华,贾玉锋,等.利用桥接组合转育的方法提高玉米花药培养诱导率的研究J.玉米科学,1999,7(3):16-18.4 韩学莉,唐祈林,曹墨菊,等.用Stock6 杂交诱导的单倍体鉴定方法初探J.玉米科学,2006,14(1):64-66.5 汤飞宇，王菲，王国英.利用SSR 标记检测来源于玉米孤雌生殖的双倍体 J.江西农业大学学报，2004，26（6）：859 862.6 才卓，徐国良，CHANGMING-TANG，等.玉米单倍体育种研究进展 J.玉米科学，2008，16（1）：1 5.,参考文献,7 Blakeslee A F,et al.A haploid mutation in the jinson weed,datura stramoniumJ.Science,1922,55:646-647.8 RandolphLF.Note on haploid frequenciesJ.Maize Genet.Coop.News Lett.,1938,12:12.9 Guha S,Maheshwari S C.In vitro production of embryos fromanthers of DaturaJ.Nature,1964,204:497.10 Opatrn伥Z,Dostl J,Martinek V.AntherCultures ofMaizeJ.Biologia Plantarum(praha),1977,19(6):477-480.11 Genovesi AD,Collins GB.In vitro production of haploid plants of corn via anther cultureJ.Crop Sci.,1982,22:1137-1144.12 刘志增,宋同明,腾文涛,等.玉米孤雌生殖诱导系的选育方法研究J.中国农业大学学报,2000,5(3):51-57.,Thank you for your attention.,感谢您的关注！,