临床基因扩增实验室验收要求和要点.ppt

临床基因扩增检验实验室验收要求和要点,宁夏回族自治区人民医院临床医学检验诊断中心 杜宗孝 2016.08,2,临床基因扩增检验实验室申报及验收程序,二级以上医院,填写临床基因扩增检验实验室设置申请书,省卫计委医政处,相应的卫生行政部门,省临床检验中心初步技术审核,合格者开始试运行（三个月），同时报省卫计委备案,验收合格后，授予验收合格证书（证书有效期五年）,（省级医疗机构）,（地、市(县)级医疗机构）,3,验收依据,医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 卫办医政发2010194号临床基因扩增检验实验室（血站核酸检测）工作导则临床基因扩增检测实验室技术验收报告,4,为什么要进行验收？,方法敏感技术要求高存在问题多假阴性、假阳性不规范人员素质,5,验收要达到的目的,保证检测质量防止实验室污染建立LAB内部质量管理模式尝试强制性实验室认可,6,7,质量管理的内涵,写你所做的做你所写的记录你已做的分析你已做的,8,PCR 实验室区域设计原则,原则上应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。,9,PCR实验室的空气流向,临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区标本制备区扩增区扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区标本制备区扩增区扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。,10,PCR实验室工作基本原则,进入各工作区域应当严格按照单一方向进行 各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的 设备、物品不得混用。不同工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区标本制备区扩增区扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。,PCR实验室工作基本原则,工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。实验台表面应可耐受次氯酸钠等化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应当方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上6090cm内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基对（bp），对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合实验室生物安全通用要求（GB19489-2008）。,12,PCR实验室技术验收内容,实验室设置和设备设施和环境人员设备管理和质控物 检测过程,标本管理 记录 报告 质量控制 抱怨,等十章共三十七条,附件1 临床基因扩增检验实验室技术验收表,本片来自李金明教授,临床基因扩增实验室设置的一般原则,各区独立注意风向因地制宜方便工作,“十六字口诀”,本图来自李金明教授 15,理想的PCR实验室设置A,16,理想的PCR实验室设置B,本图来自李金明教授,17,本图来自李金明教授,18,本图来自李金明教授,本图来自李金明教授,本图来自李金明教授,A,B,错误的设置,21,临床标本的接收,应在四个测定区域之外的地方或适合的地方。接收的标本应收集在原始容器中，不能接收从其它检测如生化、免疫检验等分出来的标本 在核酸提取时，由基因扩增检验实验室人员将标本带入至标本制备区。,23,试剂储存和准备区,功能：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。试剂准备区的仪器设备主要有冰箱、微量加样器、混匀器、可移动紫外灯、专用工作服和鞋、消耗品（带滤芯吸头、一次性手套等）、专用记录本和记录笔。加样器应定期校准。,24,标本制备区,功能：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。,25,标本制备区,标本制备区内的仪器设备主要有生物安全柜、加样器、高速台式冷冻离心机、水浴箱和/或加热模块、混匀器、冰箱、可移动紫外灯、专用工作服和鞋、消耗品（带滤芯吸头、一次性手套等）、专用记录本和记录笔。加样器应定期校准。如需处理大分子DNA，应当具有超声波水浴仪。加热模块和水浴应使用已经校准的温度计定期对所设置的温度进行校准。,27,扩增区,功能：cDNA合成、DNA扩增及检测。扩增区的主要仪器就是核酸扩增热循环仪，该仪器需进行校准。,28,产物分析区,功能：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。本区是唯一能打开扩增后反应管的地方。由于本工作区应设置为负压状态，空气流向为由外向内，以防止扩增产物气溶胶流出，故本区可无缓冲间。本区所使用的仪器设备可能有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱、测序仪等。酶标仪应定期校准，洗板机每次使用完都应进行清洗，其它如加样器和水浴箱可按有关方法进行校准。,核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标记）、直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、Southern转移、核酸测序方法、质谱分析等。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板，废液必须收集至1 mol/L HCl中，并且不能在实验室内倾倒，而应当至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理，如焚烧。,30,规定应具有的SOP,仪器设备的维护保养程序、仪器设备的校准程序、仪器设备的操作程序、临床标本的收集程序、临床标本的处理（核酸纯化）程序、临床标本的保存程序、核酸扩增及产物分析检测的操作程序、,试剂的质检操作程序、消耗品购置验收质检程序、废弃物的处理程序、内务管理程序、室内质量控制程序、抱怨处理程序。,31,实验室设置和设备检查重点,实验室的规范化分区及相应标识仪器设备及在用标识保持实验室空气流向的措施各区物品的专用标识,实验室清洁SOP要点,目的:为了使实验室台面、地面和仪器设备在使用后，处于洁净和无感染性状态，以防止出现因仪器设备不洁影响检测或仪器使用寿命；防止因实验室台面、地面和仪器设备的生物传染危险性造成实验室人员感染，以及防止实验室交叉污染而出现假阳性结果等。适用范围应包括实验室地面、台面和仪器设备等的清洁。按实验室台面、地面和仪器设备分开来写各自的具体清洁方法，要具体而又有可操作性。应规定工作人员在清洁时，必须按试剂准备区标本制备区扩增(及产物分析)区方向进行，不得逆行 规定每一工作区域的清洁必须使用专用的清洁用具，不得混用 规定有潜在生物传染危险性材料溅出时的消毒清洁方法,34,检测技术人员要求-人员培训及能力评估,培训：符合资质的人员还要接受实验室生物安全以及厂家的上岗前仪器设备操作、维护及校准等的培训。技术培训内容应覆盖工作人员所涉及的所有工作范畴，培训的评估结果是确定人员是否适合其岗位的依据。能力评估：实验室应建立操作人员能力评估机制。每年至少实施一次人员的能力评估，以评估其临床基因扩增检测工作的胜任程度。参照评估结果制定人员持续培训计划。操作人员的操作误差分析、检测过程变更可作为培训需求纳入培训活动，需记录人员的能力评估过程。,35,应有培训和能力评估的记录,37,设备管理,所有设备应得到正确维护，应有设备维护程序文件；加样器、温度计、扩增仪等设备应有明显标识表明其校准状态；实验室应保存每一台仪器设备的档案材料，对档案材料的具体内容作详细规定。,检测系统的确认、运行与维护,检测系统的确认 实验室必须实施检测系统的确认活动。确认活动包括检测系统购置前的设计确认，使用前的安装确认、运行确认和性能确认，检测系统使用后的性能监控及再确认。除应提供厂商的安装确认报告之外，实验室还应对每个检测系统进行分析灵敏度、重复性等性能进行验证。,38,性能验证：按检测系统（包括试剂）说明书进行各指标的复现,40,检 测 方 法,标准操作程序（SOP）：仪器设备操作和校准程序；标本收集处理程序；扩增检测工作程序；仪器试剂的选购和质检程序；消耗性材料的购买、验收、质检和贮存程序。必须使用经国家有关部门批准的试剂和仪器.SOP应现行有效及便于使用。,41,仪器设备的维护和校准SOP,责任人维护和校准的基本方面：光路、滤光片、波长、加热模块的清洁、具体的校准点选择（如加样器的校准体积点选择、温度计的校准温度点选择等）、维护和校准的具体方法。校准合格的判断标准 维护和校准的间隔时间,42,试剂和消耗品的质检 SOP,试剂质检的基本方面，如试剂的抗干扰能力（主要是针对提取试剂），即对溶血、脂血标本扩增抑制作用的了解。可通过自行制备含已知量病毒核酸的不同程度溶血或脂血的标本进行质检。如为定量检测试剂，还应包括检测的重复性、线性范围等的质检。如为定性检测试剂，则应重点考察测定下限，可用系列稀释的含已知量靶核酸的血清标本进行。核酸提取用离心管质检的基本方面。带滤心吸头的质检主要是滤心的密封性和抑制反应的因素。,44,标 本 管 理,本章包括五条。建立唯一编号识别系统，避免标本混淆；标本接收时的状态记录；标本的适用性和充分性；标本贮存的标准操作程序及贮存温度控制措施;标本接收及安全处置程序；维护实验室诚实性的必要措施。,临床标本的采集、运送、接收和保存 SOP,特定标本采集的具体方法步骤 明确规定标本的采集容器要求 明确标本的采集量 明确标本采集后送到实验室检测所能容许的最大时间间隔，亦即标本采集后，应在多长时间内送至实验室 明确标本采集后，在送至实验室检测前的保存方式和条件 明确标本从采集处运送至实验室过程中所要求的运送条件 明确标本接收时，签收的程序、拒收的标准和标本唯一编号的规则 规定标本在实验室内的短期（应有具体时间）和长期（应有具体时间）保存条件和要求,46,47,实验记录及其管理 SOP,日常检验过程中应记录的基本内容的规定，如仪器设备操作、维护和校准过程及有关数据；检验试剂来源和批号；检验标本的来源和唯一编号；试剂的配制；实验环境条件的控制记录；实验室清洁的记录；质控的记录；原始检测数据及其推导记录等 对实验记录者的签名方式的规定和要求 实验记录管理的基本方面：指定专门的管理人；有专门的保存处如柜子等；记录的登记归档方法；记录的借阅及销毁记录；记录保存的时间；电子记录的备份保存具体方法及保存时间等,报 告,检测结果的报告应准确、清晰和客观；定性测定报告“阴性”或“阳性”；定量测定则以拷贝数/ml或IU/ml报告；避免二者之间的混淆；每份报告应包括以下信息：标题、唯一标识、检测标本说明、标本特性和状态、标本接收日期和检测日期、检测方法、检测和校核人员签字及发出日期、参考结果或范围；如对报告有效性有疑问，实验室应立即通知临床相关科室予以改正；用电话、传真、电子邮件报告结果时的保密原则。,50,报 告？,通常报告存在的问题：唯一标识、标本特性和状态、标本接收日期、检测方法、校核人员签字,51,52,室内质量控制 SOP,明确室内质控物（阳性和阴性）的来源及浓度 明确所选用的质控方法 明确失控的判断标准或所采用的失控规则 明确失控后的分析及处理措施,参加室间质量评价 SOP,明确规定室间质评样本的接收记录方式、保存条件及实验编号规则 明确室间质评样本的检测流程，要强调的是，室间质评样本应以与临床标本相同的方式处理和检测 明确室间质评样本的报告流程，即填写、复核和签发如何进行，由谁负责 明确对返回结果的分析流程和责任人 明确室间质评检测失败的原因分析流程 明确如果测定准确性出现问题后，如何针对性采取措施的流程,54,55,56,57,投诉处理 SOP,明确投拆第一接触人对投拆的处理流程，即如何记录、如何针对相关投诉的进一步处理程序、是否需要报告和如何报告、以及如何向投拆人返回处理意见等。可将投诉分为不同类如对检验结果正确性、服务态度、报告单填写错误等分别编写处理流程 投拆有效时的如何改进和采取何种措施的具体流程。应非常具体并具有可操作性,58,实验室的日常工作管理,工 作 项 目 核 查 点水浴箱、微量恒温器（加热模块）校准及记录温度 次氯酸钠溶液 新鲜配制生物安全柜 先起动运行30分钟后再开始工作 室内质控 弱阳性质控（定性）有 低、中、高浓度质控（定量）有 阴性质控：原样本 有 经历提取过程的空管 有 仅含扩增反应混合液管 有实验台面 使用后用次氯酸钠溶液消毒，再用70%乙醇清洁 紫外照射加样器、离心机 使用后用次氯酸钠溶液消毒，再用70%乙醇清洁实验室各区 遵循单一工作流向 紫外照射,59,临床PCR检验流程记录表 检验日期 检验项目：扩增仪中保存文件名：使用说明：1本记录表须严格遵循试剂准备区标本制备区扩增区（产物分析区）单一流向移动，严禁逆向移动。2各项工作执行后，在相应叙述前的“”内打“”。3本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内，以备查找。,实验前准备 试剂在有效期内 扩增仪、加样器和温度计在校准的有效 1 期内 生物安全柜的滤膜在使用有效期内 消毒溶液在有效期内 冲眼器内无菌生理盐水在有效期内 离心管、带滤心吸头质检合格 操作者：,60,试剂准备区（1区）实验前：打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱温度：冷藏室（28）；冷冻室（182）实验室温度：（允许范围：1030）；相对湿度：（允许范围：30%70%）PCR试剂来源：（可直接列出有关厂家名称）批号：检验项目：本次实验用量：人份，剩余量：人份。其他有关试剂配制：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制1%含氯消毒液 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制4NaOH溶液 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制0.1%焦磷酸二乙酯 毫升；按XXX（将有关SOP编号列出）SOP配制 毫升；其他：仪器设备使用：离心机：正常 不正常 振荡器：正常 不正常实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外照射30分钟以上。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：,61,标本制备区（2区）实验前：打开通风设备 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭）冰箱（柜）温度：冷藏室（28）；冷冻室（182）实验室温度：（允许范围：1030）；相对湿度：（允许范围：30%70%）阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：阴性室内质控物来源：批号：扩增位置：所取理的标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：1917252101826311192741220285132129614223071523318162432核酸提取及加样过程：按XXX（列出编号）SOP进行。仪器设备使用：生物安全柜：正常 不正常 恒温仪温度校准：离心机：正常 不正常 振荡器：正常 不正常实验后：按XXX（将有关SOP编号列出）SOP清洁实验室台面、地面及仪器设备。按XXX（将有关SOP编号列出）SOP处理实验废弃物。操作者：,62,63,64,姓 名 性 别 病历号 采集时间 接收时间 标本特性 拒收原因 男 女 月 日 时 月 日 时 全血（列出原因号）男 女 月 日 时 月 日 时 全血（列出原因号）男 女 月 日 时 月 日 时 全血（列出原因号）标本拒收原因：1患者姓名不符。2标本容器为非不含任何添加剂的真空采血管。3采血量低于2 ml。4 标本采用肝素抗凝。5.容器破损。6标本采集后送检时间超过6小时。7标本重度溶血。8标本脂血。9标本不正确。10其他：,临床PCR实验室标本拒收记录,65,分析你已做的,每次实验结果的分析 表象与真象多次实验结果的综合分析 趋势的内在含义仪器设备的使用情况分析 维护与校准周期的有效性,66,技术验收的其它内容,就有关实验室质量管理方面与具体工作有关的内容进行口试和/或笔试；现场测试多为已知HBV DNA和/或HCV RNA血清盘，看实际检测和结果报告。,67,验收基本程序,材料初审：实验室设置、人员、仪器设备、试剂、标准操作程序（SOP）文件验收准备：给拟委派专家发出技术验收任务书、被验收单位发出验收通知，由省临床检验中心协调。现场验收,68,实验室技术人员资格审定,卫生技术人员资格证书 有资质单位培训证书,69,70,实验室的日常工作管理,工 作 项 目 核 查 点水浴箱、微量恒温器（加热模块）校准及记录温度 次氯酸钠溶液 新鲜配制生物安全柜 先起动运行30分钟后再开始工作 室内质控 弱阳性质控（定性）有 低、中、高浓度质控（定量）有 阴性质控：原样本 有 经历提取过程的空管 有 仅含扩增反应混合液管 有实验台面 使用后用次氯酸钠溶液消毒，再用70%乙醇清洁 紫外照射加样器、离心机 使用后用次氯酸钠溶液消毒，再用70%乙醇清洁实验室各区 遵循单一工作流向 紫外照射,71,验收原则抽样,对实验室技术人员采用抽样问询对实验室的记录采取抽样检查的方法进行抽取有代表性的部份进行检查,抽样存在有不全面的风险,72,验收方法,观察（实验室设置、仪器设备、环境和实验操作等是否规范）；审核文件（实验室SOP的规范和可操作性）询问（考核实验室工作人员对实验室工作规范化的熟悉程度）或笔试（现场笔试）现场实验（要求其按常规检测临床标本的程序进行，看其是否按实验室所制定的程序进行和记录）。,73,观 察,实验室设置实验室环境仪器、用具实验操作制度措施落实等,74,审核文件,制度程序（包括SOP）档案记录,75,询问沟通,有关硬件有关软件,76,考核口试或笔试,对实验室制度、程序等熟悉程度，如 有患者家属要求电话告知XXX丙肝的PCR检测结果，你会怎样去做？,对实验技术的熟悉程度，如 为什么在HCV RNA检测中要加水对照？,77,现场实验,考核过程考核结果,78,现场验收核心,实验室设置及仪器设备配备的科学性、合理性和充分性；文件制定的科学性、合理性和可操作性；实际运行情况和相关记录；,79,其它有关技术验收表格,验收评审意见汇总表整改要求需要说明的其它问题,80,现场验收后的意见交换,对于在验收过程中发现的问题与实验室负责人交换意见验收组将拟定的最后结论向被验收实验室通报。,81,缺陷分布表,1.实验室设置和设备4.4%2.设备和环境18.1%3.人员7.8%4.设备管理19.9%5.检测方法12.5%,6.标本管理14.5%7.记录9.3%8.报告3.7%9.质量控制5.9%10.抱怨3.9%,82,主要缺陷,2.1 工作区，能源，温控，通风等占22项2.5 试剂管理，生物防护等占31项4.2 加样器，扩增仪和酶标仪等无标识占37项4.3 加样器，扩增仪和酶标仪等档案不全占34项5.1 质检标准程序不完善占31项6.2 标本收集、处理、储存或安全处置程序不健全占31项7.1 适合自身实际困难规章制度不完善占27项9.1 质量控制操作程序不健全占23项,83,存在的问题,对设置要求理解不够深入文件准备不够充分文件容易出现雷同文件写的“太好”，给实施带来困难,84,解决方法,统一认识改进认可方式规范工作程序跟踪技术发展,85,统一认识,实验室分区使用全自动扩增检测仪的原则上有独立的三间房即可；冰箱主要控制适宜温度；不同区域的温湿度监测、能源保证要与实验要求相一致；紫外灯的目的是保证有效消毒；,86,改进认可方式,实验室可试运行3个月后，再派专家组现场审核由原有审核实验室设置和文件基础上，增加对实验室运行状态的审核；,87,缺陷分类,严重缺陷1、实验室设置不符合要求2、人员未经过培训3、仪器、试剂未经批准4、未参加室间质量评价5、未开展室内质量控制,88,附件1 临床基因扩增检验实验室技术验收表,89,评定标准,合格：5项以下一般缺陷基本合格：1项严重缺陷和/或510项一般缺陷不合格：2项（含两项）以上严重缺陷和/或11项以上一般缺陷,90,完善组织工作,技术验收工作规范评审组长须知,91,谢 谢！,谢谢聆听,