《微生物学教学课件》第七章微生物遗传变异.ppt

上节内容回顾,影响常规加压灭菌的因素抗代谢药物的定义及磺胺的治疗传染性疾病的原理抗生素的定义及分类变异和饰变的定义,第七章 微生物的遗传、变异和育种,相关定义第一节遗传变异的物质基础第二节 基因突变和诱变育种第三节 基 因 重 组第四节 基因工程,相关定义,遗传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因的总和。表型：指某一生物所具有的一切外表特征及内在特性的总和。遗传型在一定环境下的表现变异：生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。饰变：指不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、转译水平上的表型变化。,第一节遗传变异的物质基础,一 经典试验二 原核生物的质粒,一 经典试验：证明核酸是遗传信息的载体1、转化实验：1928年，Griffith等分别用肺炎R型/S型肺炎双球菌感染小鼠，得出S型肺炎双球菌可以将具有遗传功能的物质传递给R型肺炎双球菌的结论。,（1）动物实验对小鼠注射活R型菌或死S型菌 小鼠存活对小鼠注射活S型菌小鼠死亡对小鼠注射活R型菌和热死S型菌 小鼠死亡，抽取心血分离到活的S型菌,（2）细菌培养实验,（3）S型菌的无细胞抽提液试验,热死S型菌不生长（无菌落）活R型 菌 长出R型菌活R型 菌热死S型菌长出大量R型菌和10-6S型菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,平皿培养,以上实验说明：加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状，转变为S型细胞。,1944年，在以上基础上等又将S型菌的各组分分别与R型菌共同培养，得出结论S型菌传递给R型菌的不是性状本身而是遗传物质基础。,加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的是遗传因子(DNA)。,2 噬菌体感染试验：将噬菌体分别培养在具有32P 及35S同位素的培养基中，得到噬菌体粒子后再去感染细菌，10分钟后离心进行分析，发现侵入细菌细胞的是DNA而不是蛋白，并且可以繁殖得到子代噬菌体粒子。得出结论DNA 是物质基础。,A.D.Hershey和M.Chase，1952年,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,3 植物病毒重建实验：将TMV（烟草花叶病毒）及HRV（霍氏车前花叶病毒）用酚溶液进行分离，后将两者的RNA及蛋白交叉重建，重新感染烟草及车前，得出结论RNA也是遗传物质基础。,MTV HRV,HRV MTV,二 遗传物质在细胞内的存在部位和方式,（一）七个水平：1、细胞水平：几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体（原核微生物）2、细胞核水平：原核微生物：无核膜包被，并含有貭粒 真核微生物：真正的细胞核（有核膜）、线粒体、叶绿体、中心体等亦含DNA,染色体外的遗传物质：1）细胞质遗传物质线粒体或叶绿体 2）共生生物卡巴颗粒，草履虫的共生生物，15m大，具有双膜，内有DNA、RNA、酶、细胞色素等。细胞内含有几个至几百个不等。3）2质粒酵母菌细胞核中染色体外的DNA，长2m 4）质粒细菌细胞中游离于核染色体外或吸附于其上的闭合双链DNA。,3、染色体水平：不同细胞染色体的数目不同，染色体的套数亦不同。4、核酸水平：绝大多数遗传物质为DNA，只有部分病毒的遗传物质为RNA 基因组（genome）是指存在于细胞或病毒中的所有基因，实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列组成的总称。,几种代表微生物的基因组,5、基因水平：基因的物质基础是一个具有特定功能的核酸片段6、密码子水平：3个核苷酸决定一个密码子7、核苷酸水平：核苷酸是最低突变单位或交换单位,（二）原核生物的质粒,质粒上携带着某些染色体上所没有的基因，使细菌等原核生物被赋予了某些对其生存并非必不可少的特殊功能（如接合、产毒、抗药固氮、产特殊酶或降解毒物等）,1 质粒的分类 严紧型：与核染色体的复制进行同步复制。松弛型：独立进行复制，与核染色体复制不同步，拷贝数较多。,2 质粒的优点：体积小，便于使用；呈环状，不易被破坏；能够独立复制；拷贝数多，可以大量积累物质；有选择标记。,3 质粒的提取：裂解细胞去除细胞中的蛋白和RNA 分离染色体DNA 得质粒 利用电子显微镜，琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来鉴定质粒。4 质粒不能共存于同一细胞中的性质称为不亲和性。属于许多不亲和群。,DNA 的三种存在形式,5 常见质粒举例,1）F因子：62106Dal 94.5kb(为94个中等大小的多肽进行编码)2）R因子：最早在痢疾志贺氏菌中发现，抗性转移因子（含调节DNA复制和拷贝数的基因及转移基因）抗性决定子构成3）Col因子：产大肠杆菌素的因子，使其他原核生物致死的蛋白质类 ColE1：5106 Dal 无接合作用 多拷贝 ColE2：80106Dal 接合转移、严紧型控制，1-2个拷贝,4）毒性质粒：许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因5）降解性质粒：这类质粒上携带有能降解某些基质的酶的基因，含有这类基因的细菌，特别是假单胞菌，能将复杂的有机化合物降解成能被其利用的碳源和能源利用的简单形式。如，芳香族化合物、农药等。6）隐秘质粒：不显示任何表型效应，但具可检测的遗传型。,抗生素的定义及分类变异和饰变的定义质粒的分类,上节内容回顾,第二节 基因突变和诱变育种,一 基因突变二 突变与育种,一 基因突变突变：变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构突然发生的可遗传的变化（106109）,（一）突变类型,1、选择性突变株：凡能选择性培养、快速选择出来的突变型。1）营养缺陷型（auxotroph）：丧失合成一种或几种生长因子的能力而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。,2）抗性突变型（resistent mutant）：对某化学药物或致死物理因子抗性的变异类型,3）条件致死突变型（conditional lethal mutant）：在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖的突变型（如：温度敏感突变株）,2、非选择性突变株：1)形态突变型（morphological mutant）：由于突变而产生的个体或菌落形态发生变化的非选择性变异。2)抗原突变型（antigenic mutant）：抗原结构发生变异的突变类型。3)产量突变型：产量高于原始菌株的突变株称为正变株；否则为负变株。,1 突变率：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率或每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。2 测定方法：回复突变 抗药性突变,（二）突变率,菌名 突变性状突变率E.coli抗T1噬菌体3 108E.coli抗T3噬菌体1 107 E.coli不发酵乳糖1 1010E.coli 抗紫外线1 105Staphylococcus aureus 抗青霉素1 107S.aureus 抗链霉素1 109 Salmonella typhi抗25g/L链霉素1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼5 105,若干细菌某一性状的自发突变率,（三）微生物突变的特点 1不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系；2自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生；3稀有性：突变率低且稳定；,4独立性：各种突变独立发生，不会互相影响5诱变性：诱变剂可提高突变率；6稳定性：变异性状稳定可遗传；7可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变,（四）基因突变的自发性和不对应性的证明,1、变量实验（fluctuation test）,又称波动实验或彷徨试验 1943年 取两试管装有10mL对噬菌体敏感的大肠杆菌菌液 1）培养后，涂布于50个含有噬菌体的平板上，抗性菌落数目差异不大。2）分成50个小管培养后涂布于平板上，抗性菌落数目差异很大。,变量试验fluctuation test,变量试验说明：细菌是在接触噬菌体之前发生突变的，即抗噬菌体性状的产生，并非环境因素诱导的，而是自发产生的。,2、涂布试验 1949年，取12个培养皿在固体培养基上涂以相同数目的对噬菌体敏感的大肠杆菌进行培养。其中，6个平皿培养5小时后直接喷上噬菌体T1，出现28个抗性菌落。另外6个平皿培养5小时后，用灭菌的涂布棒涂布后喷上噬菌体T1，却出现353个抗性菌落,涂布试验,再次证明，抗噬菌体性状发生在与噬菌体接触之前,3、平板影印试验（replica plating）影印培养法：一系列培养皿的相同位置上出现遗传型相同菌落的接种培养方法,1952年，将对链霉素敏感的大肠杆菌涂布于不含链霉素的固体培养基上，形成小菌落后，将其分别影印于含链霉素和不含链霉素的固体培养基上，培养后在加有链霉素的固体培养基上有菌落形成；取抗性菌落周围的菌株进行液体培养，涂布于不含链霉素的固体培养基上，将培养基上的菌落分别影印于含链霉素的固体培养基及不含链霉素的固体培养基上，在含链霉素的培养基上形成的菌落数目有所增加。,平板影印培养法,在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种时间和其它研究中均有应用，值得很好地领会。,（五）基因突变的机制,1、诱发突变 简称诱变，指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因突变频率的手段。凡能提高突变率的理化因子均称为诱变剂。,1)诱变机制 碱基置换：一对碱基被另一对碱基所取代。转换（transition）嘌呤嘌呤;嘧啶嘧啶 颠换（transversion）嘌呤嘧啶,a直接引起置换的诱变剂：亚硝酸、羟胺和各种烷化剂(包括硫酸二乙脂、甲基磺酸乙脂、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）及环氧乙酸等）亚硝酸：AHG CUT GX,次黄嘌呤,黄嘌呤,亚硝酸引起的AT-GC转换细节,亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（A）次黄嘌呤（H）HNO2鸟嘌呤（G）黄嘌呤（X）这些反应及形成物均可在DNA复制中产生影响，主要是使碱基对发生转换。,碱基转换的分子机制以亚硝酸为例,羟胺引起CGTA的机制,b 间接引起置换的诱变剂：碱基类似物，如5-BU、5-AU、8-NG、2-AP等,5-BU引起的转换,移码突变（frameshift mutation）诱变剂引起DNA分子中的1个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。如吖啶黄 原黄素、吖啶橙和氨基吖啶等吖啶类染料。ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC AB+CAB CAB C ABC BCA BCA BCA BC ABC AB+CAB+CA B+C ABC ABC ACA BCA BAB CAC ABC ABC,染色体畸变：由于电离辐射、烷化剂等作用引起DNA大的损失。分为：缺失(deletion)重复（duplication）插入（insertion）易位（translation）倒位（inversion）及染色体数目的变化,染色体畸变,转座：DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体的不同部位或是其他染色体某一部位的现象。倒位：片段旋转180度，重新插入到原来染色体的位置上（顺序相反）易位：片段顺向或逆向地插入到同一条染色体的其他部位上。,转座因子：染色体组中或染色体间能改变自身位置的一段DNA顺序，也称作跳越基因或可移动基因。包括：插入序列（IS：insertion sequence）分子量小（0.71.4kb）只能引起转座效应，而不含其他任何基因。,转座子（Tn：transporson）又称易位子，除转座作用外，还含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因Mu噬菌体（即mutastor phage）转座噬菌体，温和噬菌体的一种，但其没有一定的整合位置,2 自发突变机制：,1）背景辐射和环境因素的诱变。低剂量诱变因素反复作用2）微生物自身有害产物的诱变效应 如过氧化氢等内源性诱变剂3）互变异构效应（酮式、烯醇式的互变）4）转座作用导致部分DNA环出,A-T G(-OH)-T G-C A:G,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,紫外线的主要作用是使DNA链上的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体（双链扭曲变形，不能正常配对）,修复机制：a.光复活作用（reactixlation）定义:紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下，可明显降低死亡率的现象。机制:光复活酶（photo reactivating enzyme PRE）（光裂合酶）与二聚体结合，在可见光下获得能量，使二聚体解聚。,b.切除作用（excision repair）（又称暗修复）不但可以修复紫外线损伤的DNA，还可以修复一些诱变剂（如烷化剂、x射线、射线）损伤的DNA,切除修复作用,1、由核酸内切酶切开二聚体的5末端，形成3-OH和5-P的单链缺口2、核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口。3、DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。4、连接酶将新合成的3-OH与原有的5-P相连接。,上节内容回顾,基因突变的定义突变率的定义突变类型诱变及诱变剂的定义 点突变的诱变机制（直接诱变剂、间接诱变剂及移码突变诱变剂）自发突变的机制,二 突变与育种（一）自发突变与育种 1、从生产中选育：筛选正变菌株 2、定向培育优良品种：用某一特定因素处理微生物的群体，同时不断对它们进行移种传代，以达到累积并选择相应自发突变株的目的。,（二）诱变育种 诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株。其中，诱变和筛选为主要环节。,诱变育种的基本过程：,选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,1 诱变育种的基本环节 高产突变株的选育,2 诱变育种的原则,1）选择简便有效的诱变剂：如紫外线、NTG（N甲基N硝基N亚硝基胍）、EMS（甲基磺酸乙脂）、DES(硫酸二乙脂）等。凡能改变核酸结构的因素都可影响核酸的生物学功能。,“三致”物：指的是致突变、致畸变及致癌变的物质。如黄曲霉素、反应停及二噁英等。,艾姆氏试验,定义：利用细菌营养缺陷型的回复突变菌株检测环境或是食品中是否存在致癌剂的方法。用于检验食品、饮料、药物及环境中的致癌物。试样加入鼠肝匀浆液保温后吸入滤纸置于基本培养基上培养，检验致癌物的存在与否。（要求细菌细胞应是DNA修复酶缺陷的营养缺陷型）,Ames test：对化学诱变剂做检测,菌种：鼠伤寒沙门氏菌（his-）；原理：his-在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。,Ames test 方法示意图,2）挑选优良的出发菌株：a.自发变异菌株；b.具有利性状的菌株；c.已发生变异的菌株；d.对诱变剂比较敏感的增变菌株；,3）处理单细胞或单孢子悬液 为使细胞均匀接触诱变剂，要求作诱变的菌株必须以均匀而分散的单细胞（孢子）悬液状态存在。表型延迟：由于有些细胞为多核，且大部分细胞的DNA为双链，所以只有经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型表达出来。,4）选用最适剂量：化学诱变剂剂量以在一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。,5）充分利用复合处理的协同效应：a.两种或多种诱变剂的先后使用；b.用一种诱变剂的重复作用；c.两种或多种诱变剂的同时使用；,6）利用和创造形态、生理和产量间的相关指标 建立形态与生理、产量的相关性，注意观察 创造相关性：碘淀粉水解；茚三酮氨基酸；溴甲酚绿柠檬酸,7）设计高效筛选方案 初筛（选取较多有生产潜力的菌株）、复筛（对少量潜力大的菌株的代谢产物量做精确测定）,8）创造新型筛选方法 初筛既可在琼脂平板上完成，也可利用摇瓶完成；复筛一般采用摇瓶或是小型发酵罐完成,3 三类突变株的筛选方法,(1)营养缺陷菌株的筛选 遗传型个体：a.野生型（wild type）：未发生营养缺陷突变前的菌株。b.营养缺陷型（auxotroph）丧失某种酶合成能力的突变株，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长.如E.coli（lys-）c.原养型（prototroph）缺陷型经回复突变或重组后产生的菌株,培养基类型：a.基本培养基（MM）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合的培养基。b.完全培养基（CM）：凡可以满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基（添加蛋白胨、酵母膏等）c.补充培养基（SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基（MM不能合成的代谢物）,营养缺陷型的筛选过程：a.诱变处理；b.淘汰野生型：抗生素法或菌丝过滤法；,c.检出缺陷型：夹层培养法：MM+含菌的MM+MM，长出小菌落作上标记后+CM，之后长出的是营养缺陷型。,限量培养法：诱变后的细胞放在含微量某种物质的培养基上培养，挑出小的菌落。影印接种法：先接种到CM上，接着转到MM上，寻找MM上不生长的。,逐个检出法：分别接种到MM、CM上，在MM上不长而在CM上生长的为缺陷型,d.鉴定缺陷型：生长谱法：培养基和菌液混合铺平板，分区域添加微量的氨基酸、维生素、嘌呤等生长因子，观察哪个区域长出菌落，其对应的生长因子则为缺陷的。营养缺陷型突变株的应用：标记菌株、解除反馈抑制作为高产菌株,纸片1:氨基酸混合液;纸片2:维生素混合液;纸片3:核酸水解液;纸片4:酵母水解液,氨基酸缺陷型,氨基酸和维生素缺陷型,核苷酸缺陷型,(2)抗药性突变株的筛选,对抗代谢药物的抗性突变菌株（通过高产代谢产物来实现抵抗作用）可以利用梯度平板法定向筛选。,定向培育抗异烟肼的吡哆醇高产突变株 先在培养皿中加入10mL融化的普通琼脂培养基，皿底倾斜，凝固后放平，倒上含有适度浓度异烟肼的琼脂培养基，凝固后涂布上大量的诱变菌株，培养后，发现随着异烟肼的浓度增加，抗性菌落减少。说明抗性菌株是通过产生大量的吡哆醇来解除异烟肼的抑制,梯度平板法,方法：梯度平板法（gradient plate）,抗药性突变株的应用：作为菌株的遗传标记作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）,(3)产量突变株的筛选,琼脂块培养法：将诱变后菌株的单细胞悬液涂布于固体培养基上，待长出小菌落后用打孔器将小菌落琼脂块移至空白培养皿中继续培养45天，消耗完所有营养，移至混有供试菌的固体培养基上培养，测定抑菌圈的大小，筛选抗生素高产菌株。,上节回顾,定向培育的定义诱变育种及原则艾姆氏试验野生型、营养缺陷型、原养型？MM CM SM？营养缺陷型的筛选过程抗药性突变株的筛选方法高产突变株的筛选方法,第三节 基 因 重 组,基因重组（gene recombination）：两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新型个体的方式。,一 原核微生物的基因重组,（一）转化：受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象。脱氧核糖核酸(DNA)酶可以抑制转化作用。,感受态：在一个生长过程中的细菌培养物中只有某一阶段中的细菌才能作为可转化的受体。能接受转化的这一生理状态称为感受态。出现在生长曲线的指数后期,诱发感受态的方法：a.先培养在营养丰富的培养基中，再培养在贫营养的培养基中，会出现感受态。b.用氯化钙也可诱发感受态。调节感受态的一类特异蛋白称为感受态因子，包括膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素及几种核酸酶。,降解,吸附,切割成45106,单链入胞,同源部分配对、整合,复制分裂，只有一个子代DNA分子获得供体基因,转化的过程,strr,strr,转染：噬菌体和其他病毒的DNA（或RNA）抽提出来让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒后代,转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。（转导子）,（二）转导,完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介,使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象。,噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1）包入的完全是噬菌体的DNA（正常噬菌体）2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体）3）包入的是部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。,1、普遍转导：利用完全缺陷噬菌体作为载体1）完全普遍转导：整合至受体细胞染色体上，一直随其复制，赋予受体以供体部分遗传性状。2）流产普遍转导：外源DNA在受体菌中既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失而仅进行转录、转译和性状表达。,完全普遍性转导,鼠伤寒沙门氏菌,A-B+色氨酸缺陷型,A+B-组氨酸缺陷型,流产普遍转导,2 局限转导：1）低频转导（LFT）指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，因为只能形成极少数（10-4-10-6）转导子，所以称为低频转导。,部分缺陷噬菌体介导的,发生误切频率10 4 10 6 因此 形成转导子的频率低,2）高频转导（HFT）诱导双重溶源菌就会产生50%左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物（HFT lysate），用这种裂解物转导受体菌，可获得高达50%左右的转导子。双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌。(来源：LFT裂解物以高的感染复数感染宿主),3、溶源转变 不同于转导，只是由于溶源化而被赋予受体细胞新的性状（不携带外源基因，噬菌体是完整的）；是溶源化的宿主而非转导子，随噬菌体消失则新性状亦消失。,（三）接合（conjugation）1 定义 接合是指供体菌（F）通过其性菌毛与受体菌（F-）相结合，前者传递不同长度的ssDNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。,接合示意图,2 能进行接合的微生物种类 主要发生在细菌和放线菌中。细菌中的克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弧菌属等及放线菌中的链霉菌和诺卡氏菌等,3 E.coli的4种接合型菌株,F+菌株,Orit：起始子,F-菌株,Hfr菌株：高频重组菌株，F+整合在染色体上成为附加体的状态，若与F-接合，有很高的重组频率。1）细胞接触2）Hfr断裂、转移、复制3）接合中断4）形成接合子,F 菌株（质粒带有部分染色体片断的菌株）初生F 菌株次生F 菌株,（四）原生质体融合（protoplast fusion）,概念：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的遗传性稳定的融合子（fusion）的过程，称为原生质体融合。,适用范围：各种生物细胞都能进行原生质体融合，包括各种原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。,原生质体融合的主要步骤：,选择亲株 制备原生质体原生质体融合 原生质体再生 筛选优良性状的融合重组子,二 真核微生物的基因重组（一）有性杂交：性细胞接合，从而染色体重组。（二）准性杂交（parasexual hybridization）指一种在同种而不同菌株的体细胞间发生的融合，它可不借减数分裂而导致低频率基因重组产生重组子。,准性生殖的过程：,菌丝联结 异核体形成（质配）核配形成杂合二倍体体细胞交换和单倍体化。,第四节 基因工程,一 基因工程定义二 基因工程的基本操作三 基因工程的应用,一 基因工程定义,基因工程又称遗传工程，是指利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、改造和重建细胞的基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度的满足人类活动的需要。,二 基因工程的基本操作：1、目的基因的取得：1）从供体细胞分离DNA2）mRNA反转录得cDNA3）由化学方法合成特定工程的基因,2、载体的选择：有自我复制能力的复制子，能在受体细胞中大量增殖；只有一个限制性内切酶口；具选择性遗传标记。,3、目的基因与载体DNA的体外重组：限制性内切酶作用，粘性末端可以直接重组;“平头”末端，需要合成poly（A）或poly（T）的尾巴，退火进行重组4、重组载体引入受体细胞5、重组体克隆的筛选和鉴定,三 基因工程的应用 在现代化工业生产中，如肽类药物、疫苗等等方面得到一定程度的应用；传统工业发酵中的生产菌株经过多次重组育种后。产量大大提高；采用基因重组手段改造动、植物，使其形状更加优良；在环境保护方面，采用接合手段得到多种“超级菌”，应用在污水处理中,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一 菌种的衰退与复壮二 菌种的保藏,一 菌种的衰退与复壮衰退：指由于自发突变的结果，使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。复壮：（狭义）从衰退的菌种中纯种分离和测定生产性能，从而从已衰退的群体中找出未衰退的个体（广义）在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作以期菌种的生产性能逐步有所提高。,（一）衰退的防止：1、控制传代次数（自发突变率下降）2、创造良好的培育条件 3、利用不易衰退的细胞传代 4、采用有效的菌种保藏方法,（二）菌种的复壮 1、纯种分离，分为菌落纯和细胞纯。2、通过宿主体内生长进行复壮 3、淘汰已衰退的个体,最好采用休眠体（如分生孢子、芽孢），创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥（五氧化二磷、无水氯化钙）、低温、缺氧、缺乏营养及添加保护剂或酸度中和剂,二 菌种的保藏,菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上,菌种保藏的方法,低温保藏法方法：菌种斜面置4冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。,干燥保藏法 将菌种置于土壤、细砂、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。,液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,几种常用菌种保藏方法的比较,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,