《实验动物与管理教学课件》转基因动物.ppt

动物转基因技术,转基因技术相关概念1.转基因：在DNA操作过程中整合到宿主细胞染色体上的外源基因 转基因技术包括下列：转基因的重组子构建技术-构 重组分子导入宿主体内的转化技术-转 转基因在受体细胞染色体上的稳定整合-整 转基因的可控性表达技术-表2.转基因生物品（GMO或TO）：含有转基因并为其遗传修饰了的动 植物发育个体,转基因动物(Transgenic Animal)是指通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。（曾溢滔院士）,3、转基因动物,转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。,1982年，华盛顿大学制备的著名“超级小鼠”将大鼠生长激素导入小鼠,转基因动物技术是指借助基因工程技术将体外重组的结构基因导入受精卵或早期胚胎，培育出转基因动物的技术。,4，转基因动物技术,转基因动物技术的发展简史回顾,1、第一例嵌合体小鼠1974年最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中（如图），得到部分组织中含有SV40DNA的嵌合体小鼠。但无任何表型改变。2、第一个转基因小鼠系 1976年建立了世界上第一个转基因小鼠系，这些小鼠基因组中插人了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒与小鼠卵裂球共培养把外源DNA插入到小鼠的基因组中。3、第一例显微注射法产生转基因小鼠 1980年，Gordn等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。,4、“超级鼠”1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠2倍的“超级鼠”，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物具有生物活性。5、转基因家畜的产生 转基因家兔、绵羊和猪(Hammer等，1985)、牛(Bondioli等，1988)和山羊(Ebert等，1991)等相继出世。,6、利用转基因生产重组蛋白 1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了-抗胰蛋白酶。目前，已有数十种蛋白实现了转基因生产。7、转YAC的转基因小鼠 近10年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（YAC）DNA来产生转基因小鼠。,转基因动物实例一,超级奶牛普通奶牛的三倍大（英国）,转基因动物实例二,东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪 绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆,转基因动物实例三,转绿色荧光蛋白的兔,12,四、转基因鱼,转基因动物实例四,正在进行转基因山羊的实验,乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊,上海交通大学医学遗传研究所,just a joke,转基因动物操作技术流程,获取外源目的基因 含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物,简明操作步骤,转基因技术操作的具体流程,一、目的基因的设计 转基因可分为随机整合型基因和基因敲除（gene knockout）型载体基因。随机整合型基因要求结构完整，包括5上游启动子区和3下游区等，多用基因组文库（如BAC文库）筛选。也可人为改造基因，改造基因可选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性。基因敲除（gene knockout）型载体基因要设计与待剔除基因的同源性的载体基因。二、重组载体的构建 选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源基因的表达、能接受外源DNA容量大小、稳定、有一定滴度、对宿主细胞无威胁。,三、重组载体的体外验证（in vitro）重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。对于连有组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体，需先在同类型的体外离体培养细胞中初步验证表达特性。四、基因转移 基因转移方法主要有3类：1）化学法 2）物理法 3）生物法,五、转基因动物模型的验证 国外杂志一般需要从基因组、mRNA、蛋白质和整体表型各个层次进行验证。FISH杂交、聚合酶链反应（PCR）、免疫印迹杂交（Southern Northern blotting）、酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法等多种方法，先筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后分别在mRNA和蛋白水平上检测外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转基因动物的生理功能和是否出现某些疾病病症状的表型等。,19,六、组建转基因系 第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外源DNA才能在后代中稳定遗传。,转基因动物的制作方法,一、受精卵雄原核显微注射法二、胚胎干细胞（ES细胞）法三、逆转录病毒感染法四、体细胞核移植法五、精子载体法六、YAC法,一、雄原核显微注射法,以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。,这一方法的实验程序如下：载体DNA制备 受精卵准备胚胎操作过程显微注射 假孕母鼠准备(养母)胚胎移植对幼鼠鉴定,用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性很强，即使是受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5。因此人们往往来用增大微注射受精卵的数目的办法来弥补这一缺陷。,优点：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观；整合率高缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默,注意事项：1.显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体细胞后，在染色体上的整合位置是随机的.2.外源基因甲基化程度在胚胎发育过程中会影响其活性.3.某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正常调节机制的控制.4.由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还具有一定的组织特异性.,2、胚胎干细胞（ES细胞）法,ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。,(1993)Nature 365,8789,28,优点：外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定 位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及 筛选方便,缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体,目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。,将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的),获得转基因动物的方法。,3、逆转录病毒感染法,优点：受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高,缺点：容纳大小有限 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性,4、体细胞核移植法（转基因克隆）将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。,36,核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术。根据核供体的来源不同，可将其分为 胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物技术。,优点：转基因效率显著超过显微注射可以方便的建立生产畜群可以预测基因表达水平可以使用定点整合目标基因的技术,已经成为标本的多莉将永远被人们记住！,永恒的多莉,39,1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊了世界。日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊”。,相关资料：克隆动物,（一）几个基本概念克隆（clone，cloning）即无性繁殖，是指由一个细胞或个体以无性方式重复分裂或繁殖所形成的一群细胞或个体。克隆动物（cloning animal）是利用显微外科技术，将一个体细胞核移植到一个去核的卵细胞中，再植入母体子宫，便可不经授精而发育成的一类动物。全能性（totipotency），哈布兰德1902年提出全能性学说，该学说认为任何一个处于细胞分化临界期之前的细胞，只要处于合适的条件下，既可发育为完整的生物体，也可发育为任何组织、器官及其任何终末细胞。,多能性 指具备分化为多种组织、器官及终末细胞的能力。供体（donor）提供细胞核的一方。受体（receptor）接受细胞核的一方。,体细胞克隆技术 1997年2月17日是1个让全世界震惊的日子，英国Roslin研究所的Wilmut从1只六岁母羊的乳腺上皮细胞成功的克隆到了一只绵羊一多利(Dolly)。这是人类第一次采用分化的体细胞作为供体细胞，它的成功是20世纪生物学重大突破之一。学术意义在于证明分化的体细胞甚至是分化终端的体细胞核仍有全能性。,（1）体细胞系的建立；（2）Go期的诱导；（3）卵母细胞收集和去核（4）细胞融合与激活（5）重组胚的培养（6）胚胎移植（7）体细胞移植后代的鉴定，确定后代是否真的来源于供体细胞系细胞。,（三）动物体细胞克隆的路线,优点：对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提转基因的效率，不仅具有“ES细胞途径”的全部优点，且物种适用面广。无需经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。,缺点：技术上难度大，成功率极低，胚胎死亡率高，非一般实验室可以开展。,5、精子载体法 直接以精子为载体的转基因方法：将成熟精子 与外源共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后，使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色体。,目前国际上只有1例成功模型，国内也很少有相关报道，精子载体法很少被应用。,6、YAC法 利用酵母人工染色体()作为载体制作转基因动物的方法。酵母人工染色体（）载体是近年来发展起来的新型载体,能克隆百万对碱基的大片段。,优点：保证大片段的完整性保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率高 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。,因此介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。除上述几种常用的转基因方法外，人们为了适应于一些特殊需要也探索了一些其他的方法。这些方法都不太成熟，其应用也正被人们验证。,转基因动物研究出现的问题,1、制作转基因动物效率低 2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制 3、转基因表达水平低,1、制作转基因动物效率低 这是制约这项技术广泛应用的关键。以显微注射法生产转基因动物为例，小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊转基因阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%,0.9%。,2、基因在宿主基因组中的行为难以控制转基因随机整合于动物的基因组中，很有可能引起宿主细胞染色体的插入突变，还可造成插入位点的基因片段的丢失及插入位点的基因的位移，同时也可能激活正常情况下处于关闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。,3、转基因表达水平低 许多转基因的表达水平受到宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达，影响转基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平较低,极少部分表达水平过高。,进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体水平的表达调控规律。转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。,转基因动物的意义,56,什么是基因敲除技术？基因敲除（gene knock out）是80年代初出现的一项新的基因工程技术。采用同源重组的方法,用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物,即为基因敲除动物。,57,基因敲除技术的应用1、研究基因调控和基因功能；2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料；3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学；4、治疗遗传病，即基因治疗。5、改造生物、培育新的生物品种。,58,病毒介导转移法,病毒介导基因转移(virus mediated gene transfer)是指以病毒为载体，将外源性目的基因通过基因重组技术，组装到病毒载体上，并使重组病毒感染受体宿主细胞，完成基因转移。,59,逆转录病毒(retrovirus),优点,能高效转染宿主细胞，转染率可达100宿主范围广泛可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所载的外源基因都能表达,缺点,病毒容量有限(7 kb)随机插入有致癌作用,