《大学化学教学课件》分子生物学研究法.ppt

分子生物学研究法（上）,1、重组DNA技术发展史上的重大事件2、DNA操作技术3、RNA的基本操作技术4、SNP的理论与应用5、基因克隆技术6、蛋白质组与蛋白质组学与技术,分子生物学从20世纪中叶开始高速发展，最主要的原因之一是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作：DNA的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变和PCR扩增。这是分子生物学研究的核心技术。基因工程：在体外将核酸分子插入载体分子中，使之进入寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。,跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA与RNA操作技术、基因克隆技术以及蛋白质组学等几个分子生物学研究方法的关键环节。,重组DNA技术史上的重大事件,半个世纪以来，分子生物学研究取得了前所未有的进步，主要有3大成就:第一，解决了遗传的物质基础问题-基因的分子 载体是DNA;第二，DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题;第三，“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。,DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。限制性核酸内切酶能从特定碱基序列位点切开DNA。1972，Boyer实验室发现核酸内切酶EcoRI能特异识别GAATTC序列，将DNA在这个位点切开产生具有粘性末端的小片段。,他们还发现，EcoRl酶切产生的任何不同来源的DNA片段能通过粘性末端之间碱基互补作用而彼此“粘合”起来。此后，大量类似于EcoRl 但具有独特识别序列的核酸内切酶被陆续发现。到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电冰技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。,DNA操作技术核酸的凝胶电泳,1.基本原理 生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。,在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。,2.琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。经过化学修饰的低熔点琼脂糖，在较低的温度下便会熔化，常用于DNA片段的制备电泳。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间;聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为11000bp 之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。例如，20%的聚丙烯酰胺凝胶可分离1-6bp的DNA小片段，而若要分离1000bp的DNA片段，就要用3%的聚丙烯酰胺凝胶。再如，2%的琼脂糖凝胶可分离300bp的双链DNA分子，而分离大片段DNA就要用低浓度(0.3%1.0%)的琼脂糖凝胶。,在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭(ethidium bromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，检测灵敏快捷，DNA带中含0.05g的微量DNA，可以清晰地检测出来。EB能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子能吸收EB并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。,载 体一载体的概念：1.要把一个有用的基因（目的基因-研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA,二、载体的分类,说明：1.穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间，如：YEP,DIDB2192.YAC Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成，对克隆大的真核基因十分有用，在HGP中发挥主要作用。3.BAC 细菌人工染色体。,三、基因工程载体的3个特点：（一）都能独立自主的复制 载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。（二）都能便利的加以检测 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。,四、克隆载体和表达载体：所有的载体可以分成两大类：克隆载体和表达载体。其中最常用的是质粒载体。1.克隆载体（cloning vector）都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。2.表达载体（Expression vector）具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。为了有效的转录，必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的SDs和RbS。这样一个基因表达需要的具有表达和调控能力的载体称表达载体。,（二）载体的元件及性质,抗生素抗性基因：（genotype）编码产物 功能（phenotype）（1）Ampr 酶 水解内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr 1个膜蛋白 可以阻止四环素进入细胞。（3）camr 乙酰转乙酶 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之 失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶 使G418失活（5）hygr 潮霉素磷酸转移酶 使潮霉素失活。,MCS-多克隆位点（multiple cloining site，MCS）是多个限制酶识别的一段DNA顺序，以便克隆/插入外源基因/DNA片段。,重组DNA技术的基本过程,基因工程包括3个步骤：1 DNA重组2 重组DNA导入宿主细胞克隆扩增或表达3 基因工程的后处理（down-stream techniques of GE）重组DNA技术的基本过程：1 载体的选择和制备分；2 制备目的基因片段切；3 DNA片段的重组连接接；4 重组DNA导入受体细胞转；5 转化子的筛选筛；6 重组子的筛选筛；7 重组子的鉴定鉴；8 克隆扩增或表达扩/表达；,(xbal I)EcoRI,EcoRI(Hind III),PUC,(xbalI),EcoRI,(Hind III),EcoRI,EcoRI,+,EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,Digestion with EcoRI,Recovery of APPAI DNA fram agarose,APOAI,PUCQ-APOAI,PBR325-APOAI,PUC9,PUC9,APOAI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,Figure8-3 strategy of construction of recombinant pucq-APOAI plasmia,E.coli,Preparation of PBR325APOAI and PHCo plasmid,Digestion of PBR325-APOAI with EcoRI,Diestion of Puco with EcoRI,Isolation and Recovery of APOAI gene fragment,Labeling of DNA probe with isotope or biotin,Ligation,Transformation of Ecoli,Selection of Transformants,Identification of plasmid plasmid by enzyme digestion,Identification of recombinatn DNA by southern hybridization,Figure8-4 The experimental process of the construction of recombinant DNA,-半乳糖苷酶失活插入型载体：这种载体的基因组中含有大肠杆菌的lacZ区段，编码-半乳糖苷酶。由这种载体感染大肠杆菌的lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑，但在克隆过程中，如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，那么由这种重组体感染的lac-指示菌，由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。（蓝白斑筛选）,基因扩增,聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。,PCR技术的原理,首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动(引导)新链的合成，所以，新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。,由一对分别与5端和3端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，合成复制模板DNA，使目的DNA得到扩增,PCR技术原理,（接下页）,PCR反应的全过程,DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。,具体说：首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(约94)环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板DNA；然后降低反应温度(约56)制冷1min，使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，72左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按53方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。,PCR反应系统组分,模板DNA（高温变性）Taq DNA聚合酶（耐高温）dNTP（底物）引物（DNA，人工合成）Mg2,模板DNA DNA、RNA都可作模板,如果是RNA，可以先反转录成cDNA再作模板。模板DNA用量为102-105拷贝,1ug人基因组DNA=3x105单拷贝,长度:15-30 mer（mer:核苷酸数）(G+C)含量:40-60%,根据其含量计算退火温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)引物序列:一对引物之间不能有互补序列引物的3端:必须严格互补引物的5端:可以不严格,可以加酶,加标记物,引入突变 位点等引物的浓度:0.2-1umol/L,特异性引物,PCR的早期,用大肠杆菌DNA聚合酶I的Kleenow片段，此酶不能耐受高温(93-95)，因此要不断添加酶 耐热Taq酶来自水生栖热菌(Thermus aquaticus),在72可以60核苷酸/S的速度延伸DNA链。其半衰期:92 2hr;95 40min;97 5min,DNA聚合酶,25-30个循环,PCR的基本原理和操作程序,RT-PCR（逆转录-PCR）,以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementary DNA，cDNA），再进行的PCR反应,模板为mRNA需逆转录酶产物为cDNA,RT-PCR与PCR区别,RT-PCR的基本原理和操作程序,基因的体外突变DNA和RNA的微量分析DNA序列测定基因突变分析,PCR的其他用途,实时定量荧光PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR 是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。,实时定量PCR（real time RT-PCR）,实时荧光定量PCR 技术的主要应用：1.DNA 或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含 量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。2.基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。3.基因分型：例如SNP 检测，甲基化检测等,原理：根据荧光染料形成特异性荧光信号的强度，计算出模板DNA或mRNA的含量 用途：定量分析mRNA或DNA优点：可进行自动化定量分析、降低假阳性,Real time PCR 常用的两种方法分别为：Sybr green（荧光染料掺入法）和 Taqman probe（探针法）SYBR green 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。此方法适用：1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上 2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。4、高通量大规模的定量PCR检测 5、专一性要求不高的定量PCR检测。,Taqman Probe PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,实时PCR的基本原理,实时定量PCR的基本过程,此方法适用：1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件 都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基 因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。,实时荧光定量PCR中的几个术语 1.Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。（如图所示）,荧光域值（threshold）：是指 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号，荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，即：threshold。Ct 值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,基因组DNA文库构建,从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库（genomic DNA library）。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。从基因组含有生物生存、活动和繁殖的全部遗传信息的概念出发，基因组文库是具有生物种属特异性的。,文库构建,提取染色体DNADNA片段插入适当的克隆载体转入受体菌扩增基因组文库,基因组文库的构建,机械法或限制性内切酶切割,基因文库构建示意图,RNA的基本操作技术,总RNA的提取RNA提取注意事项：RNA电泳：28S;18S;5SRNA纯度和浓度的测定,mRNA分离,最普遍的mRNA分离依赖于与真核生物mRNA3端poly(A)互补的含有20-30胸腺嘧啶的oligodT序列。通常将oligodT链通过5的磷酸键与纤维素基质连接，使用者可以通过其来分离纯化mRNA。Ambion公司提供了几种Poly(A)Purist mRNA Purification Kit试剂盒，这些试剂盒都是基于oligodT-纤维素原理。GE（Amersham Biosciences）公司也提供了几种利用oligodT-纤维素柱子的mRNA纯化试剂盒。BD生物科学公司和CLONTECH公司同样也提供了oligodT-cellulose试剂盒。CLONTECH公司QIAGEN公司现利用了乳胶磁珠代替了纤维素与oligodT共价连接。乳胶磁珠完美的球形表面能实现均一分布和最小的离心时间，产生纯化的mRNA。,cDNA的合成,cDNA第一链的合成 1.寡聚dT法：poly A tail 2.随机引物法：,cDNA第二链的合成方法有以下2种:1、自身引导法:合成的单链cDNA 3端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物，当第一链合成反应产物的DNA:RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段或反转录酶合成cDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步克隆。目前很少使用。2、置换合成法 该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链不用碱变性，而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的作用下合成第二链。该反应有3个主要优点:(1)非常有效；(2)直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；(3)不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。,细胞总mRNA 反转录酶 cDNA 插入合适载体转入受体菌 cDNA文库,cDNA文库的构建,在组织和培养的细胞中，一个细胞中有些mRNA可拥有数千个拷贝，而有些mRNA只有几个拷贝。根据mRNA分子含量的多寡，可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度3种不同的类型。,从表中看出低丰度mRNA，其总量约占总mRNA的30%，约有11000个左右的不同种类的mRNA。如果获得11000个克隆，得到每一种低丰度mRNA的可能只有30，因此，为了获得一个能够代表全部低丰度mRNA序列的cDNA基因文库，必须的最低克隆数(理论值)应是11000/03037000。,由于在实验中存在着取样差异，有些序列容易被克隆，有些序列不容易被克隆，为了保证cDNA文库中能够包含所有的序列，必须增加克隆的数目。为了使低丰度mRNA的cDNA克隆达到99%的期望率，需要筛选170000个克隆。,克隆基因的分离,1.应用核酸探针分离克隆目的基因:把cDNA文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，就可以与特异性的核酸探针进行菌落杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆，这个过程叫作克隆基因的分离或筛选。,应用核酸探针分离目的基因的方法叫作核酸杂交筛选法。适用于大规模筛选。只要有合适的现成可用的核酸探针，就有可能从生物体的任何组织中分离到目的基因，也就能够有效地检测任何一种插入的外源DNA序列。,分离克隆基因的办法很多，根据不同的需要再去学习具体的方法，这里就不作一一介绍了。p177,