食品检验技术第三章.ppt
第三章 食品微生物检验的常用试剂及配制,学习重点,了解染色的基本原理。掌握常用染料的性质及其染液的配制技术。掌握常用试剂、缓冲溶液、物质的量浓度的 配制技术。了解培养基的种类及一些常见培养基的用途，掌握一般培养基的配制技术。,一、染料的种类,染料可按其电离后染料离子所带电荷的性质，分为酸性染料（如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味酸等）碱性染料（如美蓝、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性 红、孔雀绿和番红等。）中性（复合）染料单纯染料,第一节 染料及染液配制技术,第一节 染料及染液配制技术,二、染料的使用条件酸性染料：当培养基因糖类分解产酸使 pH 下降时，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色。碱性染料：菌体蛋白质电离后带负电荷，而碱性染料电离时染料离子带正电荷。因此，带负电荷的细菌常和带正电荷的碱性染料进行结合。所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。,第二节 常用试剂的配制技术,（一）缓冲液的配制技术 在微生物检测过程中，许多化学反应必须在一定的pH范围内进行，为了保证反应的完成，需要寻找和使用各种能对体系酸度起稳定作用的物质来控制不同体系的pH。凡是能使溶液pH控制并稳定在一定的范围之内，当有少量的酸或碱加入溶液时，仍能控制溶液的pH不发生显著变化的试剂称为缓冲溶液。,（一）缓冲液的配制技术,1 磷酸缓冲液的配制 2 醋酸缓冲液的配制 3 柠檬酸一磷酸盐缓冲液的配制 4.1 mol/L Tris 缓冲液 5.0.5mol/L EDTApH8.0 缓冲液,（二）物质的量浓度溶液的配制技术,溶液浓度表示法（1）物质的量浓度（mol/L）在生化和微生物实验中还常用 mmol/L 和mol/L 表示溶液的浓度。（2）质量浓度（kg/L）（3）质量摩尔浓度（mol/kg）,（二）物质的量浓度溶液的配制技术,物质的量浓度溶液的配制方法 物质的量浓度要求的精确度为 1/l00。配制时溶质称量需用 1/l000 的天平，溶剂体积要用容量瓶定量。,（二）物质的量浓度溶液的配制技术,溶液浓度的调整（1）溶液稀释法即将已知浓度的浓溶液稀释成所需要某浓度的溶液。根据浓度与体积成反比的原理进行计算配制：C1 x V1=C2 x V2,C1 浓溶液浓度；V1 浓溶液体积；C1 稀溶液浓度；V1 稀溶液体积；,（二）物质的量浓度溶液的配制技术,交叉法计算设 a 为高浓度溶液的浓度，b 为低浓度溶液（或水）的浓度，c为所需溶液的浓度，应用交叉法：a b（c b=x）c x y（a c=y）x=所需 a 的体积，y=所需 b 的体积。,（二）物质的量浓度溶液的配制技术,溶液浓度的调整（2）稀溶液调整为浓溶液法 仍按照溶液浓度与体积成反比的原理及交叉法计算。公式为：,C1 浓溶液浓度；V1 浓溶液体积；C1 稀溶液浓度；V1 稀溶液体积；C 所需溶液浓度；,C x（V1+V2）=C1 x V1+C2 x V2,注意要点：,配好的试剂溶液应该放入体积合适的试剂瓶中。见光容易发生变化的试剂应该放入棕色瓶或将 瓶放在暗处。试剂瓶上应贴上标签。标签上应写明试剂浓度，缓冲溶液还应注意 pH、试剂名称和配制日期。,（三）pH 指示剂的配制技术,酸碱指示剂通常是指随着溶液 pH 的改变而伴随着颜色变化的一类物质。这类指示剂或失去质子由酸式转化为碱式，或得到质子由碱式转化为酸式，从而发生颜色改变，所以将这类指示剂称为 pH 指示剂。在微生物鉴定、检测过程中，经常要用到此类试剂。,第三节 培养基,培养基是用人工方法，将多种物质按照各类 微生物生长繁殖所需要而配制的一种混合营 养料。食品微生物检测时，为了得到准确的 结果，需要对微生物进行扩大培养，常用到 各种不同的培养基。现在已经有用于微生物 检测的各种制备好的培养基购买。但作为食 品检验工作者仍应掌握培养基的相关理论知 识和配制技术。,第三节 培养基,培养基的分类根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分：）天然培养基 天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、马铃薯、牛奶、血清等。）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养 基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分 精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用 于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或 者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成 培养基。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。,优点：取材便利、营养丰富、配制简便；缺点：营养成分难以控制、实验结果的重复性较差。,天然培养基：,第三节 培养基,根据培养基的物理状态来区分：）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.21%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,液体培养基,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,液体培养基,固体培养基,半固体培养基,无动力 有动力(弥散),(是否运动),液体培养基：主要用于工业生产；固体培养基：主要用于分离、鉴定等；半固体培养基：主要用于观察、保藏菌种。,根据培养基的用途来区分：1）选择培养基 在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。2）增殖培养基 在自然界中，不同种的微生物常生活在一起，为了分离我们所需要的微生物，在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其他微生物，这种培养基称为增殖培养基，这种培养基常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。3）鉴别培养基 是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌落的培养基。(伊红美蓝琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、亚硫酸铋琼脂、微生物快速显色培养基）,培养基配制原则：,目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等 确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对 培养物质的需求不同。营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.57.5；放线菌pH为：7.58.5；酵母菌pH为：3.86.0；霉菌pH为：4.05.8。,培养基 pH 的测定与调整,培养基配好后，一般要调节至所需的 pH，常用盐酸及氢氧化钠溶液进行调节。调节培养基酸碱度最简单的方法是用精密 pH 试纸进行测定。用玻璃棒沾少许培养基，点在试纸上进行对比。如 pH偏酸，则加 3氢氧化钠溶液，偏碱则加 3盐酸溶液。经过反复儿次调节至所需的 pH。此法简便快速，但毕竟较为粗放，难于精确。要准确地调节培养基至所需的 pH，可用酸度计进行。,微生物正常代谢过程中pH会不会改变？如何维持培养基中pH的相对恒定？,微生物在生长代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成，往往会改变环境中的pH。可在培养基中加入缓冲剂，最常用的缓冲剂是K2HPO4/KH2PO4,培养基的成分,(1)水 水是微生物生存的基本条件。水与微生物细胞正常胶体状态的维持、养料的吸收、代谢废物的排泄以及细胞内的全部代谢生理活动息息相关。因此，水是微生物生命活动不可缺少的条件。(2)碳源 碳源是组成微生物细胞的主要元素。在实验室条件下，制备培养基最常用的碳源为葡萄糖，可为许多微生物利用。其他糖类如蔗糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉、纤维素，以及脂肪、有机酸、醇类、烃等都可作为培养不同微生物时选择使用的碳源。,培养基的成分,(3)氮源 氮源是组成细胞蛋白质的主要成分，也是构成所有微生物细胞的基本物质。常用于培养基的氮源，分无机氮和有机氮两类。无机氮有铵盐、硝酸盐等。大多数真菌利用铵盐及硝酸盐；许多细菌能利用铵盐，但不能利用硝酸盐。有机氮有蛋白陈、牛肉膏或牛肉浸汁、多肤及各种氨基酸等。此外，麦芽汁、酵母膏等也是常用的有机氮源。一些含蛋白质较多的农副产品如豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼等常可作为培养放线菌的氮源。,培养基的成分,(4）矿质营养 微生物需要的矿质养料可分为主要元素和微量元素两大类。主要元素包括磷、钾、钙、镁、硫、钠等六种。它们分别参与细胞结构物质的组成、能量转移、物质代谢以及调节细胞原生质的胶体状态和细胞透性等。培养基中添加这些营养一般采用含有这些元素的盐类即可，如磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、氯化钠等。,（5）生长因素或生长因子 它是一类需要量很少但却能促进微生物生长的有机化合物的统称。微生物生长所需的生长因素大部分是维生素物质。常见的种类主要是硫胺素、核黄素、烟酚胺、泛酸和叶酸等。它们是许多酶的组成部分，具有维持生物代谢的功能。,培养基的成分,常用培养基的制备技术,培养基制备的基本方法和注意事项 培养基成分的称取 各成分的混合和熔化 培养基pH的初步调整 培养基的过滤澄清 培养基的分装 培养基的灭菌 培养基的质量测试 培养基的保存,常用培养基的制备技术,营养琼脂培养基配方及制法,蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000mL,将琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.27.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂熔化，分装。121高压灭菌15min。,培养基的分装及斜面摆放,成品培养基：这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法，真空干燥法，低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理，充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶解，无需调pH，分装，高压蒸汽灭菌，即可使用。成品培养基很容易吸潮，在称量时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱手套防止烫伤。分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。,注意事项,培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在37 恒温箱培养24小时，无菌者方可使用。在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。蒸汽灭菌为121，15-20分钟，干热灭菌为160-170，2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。,培养基灭菌,培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以68套做一 包，待灭菌。吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将右端多余的报纸打一小结。三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45角，并将右端多余的报纸打一小结。,包扎,灭菌,关好排水阀门放入清水至标度为止。将要灭菌的物品用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖。通电加温，同时打开排气活门，当有大量蒸汽排出后维持5min，排尽锅内的空气，再关闭活门。当达到所需温度时开始计时，并在此温度下保持所需的时间。灭菌完毕，不可立即开盖取物，须关闭电源，待压力自然下降，当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时，方可打开锅盖取出物品。最后将高压灭菌器内的剩余水排出。,放置斜面,
