食品中微生物标准检验与分析技术.ppt

第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,食品卫生检验与管理,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,一、菌落总数介绍,食品验样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1mL（或1g)验样中形成菌落的总数。国家标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,食品污染程度的标志,预测食品存放的期限,卫生学意义,二、检验方法,菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每mL）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释-倾注平皿-培养48小时-计数报告。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,三、检验程序,GB/T4789.2-2003,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,四、操作步骤,（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量 1、500mL广口瓶 1个 2、500mL三角瓶1个 3、250mL三角瓶 2个 4、18180mm试管3支 5、1mL移液管5 支 6、直径为90mm平皿 10套 7、250mL量筒1支 8、玻璃珠：直径约5mm 9、剪刀1把 不锈钢药匙1把,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,样品：袋装鲜奶1操作方法 用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25mL，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入，振摇均匀，即为1:10的稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL灭菌吸管。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,（二）样品的处理和稀释,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,（二）样品的处理和稀释,1操作方法 根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46平板计数琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,（二）样品的处理和稀释,（四）菌落计数,1、计数时应选取菌落数在30300之间的平板（SN标准要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。,2、若所有稀释度均不在计数区间，如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。,（四）菌落计数,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,3、不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。,4、当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,（四）菌落计数,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,（四）菌落计数,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,5、当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数,五、菌落数报告,按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。,报告方式以下表为例,（四）菌落计数,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一节 总菌落数的检验与分析,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,大肠菌群是指一群在37培养24小时能分解乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。作为粪便污染指标，有广泛的卫生学意义。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,第二节 大肠菌群的检验与分析,检测步骤,1、检样稀释,MPN：表示食品中大肠菌群数是以每100mL或克检样内大肠菌群最近似值，一般采用9管法。一般样品25mL（克）+225mL生理盐水=1：10，从此10-1取样10mL，则其中含样品为1mL（克）。接种到3管双料乳糖发酵管中。从此10-1取样1mL，则其中含样品为0.1mL（克）。接种到3管单料乳糖发酵管中。表142143。从10-1取样1mL+9mL生理盐水=1：100，从10-2取样1mL，则其中含样品为0.01mL（克）。接种到3管单料乳糖发酵管中。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,2、乳糖发酵试验,（1）培养基 单料乳糖胆盐发酵管：蛋白胨 2%猪胆盐（或牛胆盐）0.5%乳糖 1%、1.6%溴甲酚紫酒精液 0.06ml pH 7.4。制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115高压灭菌15min。双料乳糖胆盐发酵管 除蒸馏水外其他成分加倍。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,（2）原理 溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，如果颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群；如果颜色变黄色，说明可能出现能分解乳糖产酸的大肠菌群。胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖。分解乳糖产酸产气的大肠菌群，看小倒管中的气体。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,杜氏发酵管产气情况,1产气 2不产气,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,3、鉴别和分离培养,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,4、证实试验,（1）革兰氏染色：阴性、短杆菌（2）乳糖复发酵：产酸产气,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,粪大肠菌群的检验,检验的稀释 乳糖发酵试验 证实证验（EC肉汤发酵 伊红美蓝培养基）结果评定,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,EC肉汤（大肠杆菌检验肉汤,E.Coli Broth）,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,第一个半天 器材准备,准备器材并灭菌，如下：1、250mL三角瓶 1个2、18180mm试管 2支 3、乳糖发酵管（带黑帽或棉塞，有刻度试管，内带小倒管）15支4、250mL量筒 1支5、1mL移液管 2支6、10mL移液管 2支7、平 皿 6套,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,第二个半天 样品处理及初发酵,1、样品处理2、检样稀释与乳糖胆盐发酵试验3、培养1826小时，于3537摄氏度,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,第二天 伊红美蓝培养基分离培养接种EC肉汤（粪大肠菌群）,1、伊红美蓝培养基分离培养2、接种EC肉汤（大肠杆菌检验肉汤,E.Coli Broth）,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,伊红Y是一种酸性染料,有色部分为阴离子(E-)美蓝是一种碱性染料,有色部分是阳离子(M+)。细菌细胞的主要成分是蛋白质,由于蛋白质系两性电解质,在偏酸性环境中正电荷增多,易与伊红结合,在碱性环境中负电荷增多,易与美蓝结合。而细菌发酵乳糖是产酸的.美蓝并不是完全不起作用，多见于典型的大肠杆菌(乳糖发酵很迅速),在伊红染成粉红色之后,美蓝可以继续将其染成紫黑色带金属光泽的菌落。,第三天 证实试验,1、乳糖复发酵试验2、从阳性EC肉汤接 种EMB分离培养。3、EMB典型菌落革 兰氏染色镜检,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,革兰氏染色：阴性、短杆菌,第四天 观察结果与器材消毒与清洗,1、观察乳糖发酵管结果2、观察EMB培养结果并革兰氏染色镜检3、器材消毒与清洗4、查表报告结果与撰写实验报告,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 大肠菌群的检验与分析,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,沙门菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门杆菌。,一、沙门氏菌生物学特性,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。,1、沙门氏杆菌简介,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。已发现的近一千种（或菌株）。按其抗原成分，沙门氏菌可 分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。其中与人体疾病有关的主要有甲组的副伤寒甲杆菌，乙组的副伤寒乙杆菌和鼠伤寒杆菌，丙组的副伤寒丙杆菌和猪霍乱杆菌，丁组的伤寒杆菌和肠炎杆菌等。,1、沙门氏杆菌简介,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,形态、染色G-杆菌 0.6-1.0um2-4um周身鞭毛，有菌毛。,沙门氏杆菌的形态大小,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,生化反应,不分解乳糖（亚利桑那菌除外），分解葡萄糖产酸产气（伤寒沙门菌产酸不产气）。多数产生H2S，不产生靛基质，不液化明胶，不分解尿素，不产生乙酰甲基甲醇，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,沙门菌病,目前至少有67种O抗原和2000个以上血清型，所致疾病称沙门菌病。肠热症-是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。急性肠炎（食物中毒）-是最常见的沙门杆菌感染。多由鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌等引起。败血症-常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,三、沙门氏菌检验,中华人民共和国国家标准,GB/T 4789.4-2003,微生物学检验,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,TSI（排除A/A H2S结果），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸,沙门氏菌血清学试验,H2S 靛 尿KCN 赖,H2S 靛 尿KCN 赖/,非如左述的各种反应结果,沙门氏菌血清学试验,沙门氏菌,非沙门氏菌,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,前增菌：25克（加工食品）+225毫升缓冲蛋白胨 37度培养4小时（干蛋品1824小时）。增菌：移取10毫升接种于100mL的增菌液中。氯化镁孔雀绿（MM）或四硫酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）。,（一）前增菌和增菌,（二）分离培养,最适生长温度为3537，最适pH值为6.87.8。选择性琼脂平板：BS培养基（亚硫酸铋琼脂）、DHL琼脂、HE（海克顿肠内琼脂培养基）或WS琼脂、SS琼脂。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,（三）五项生化试验,1、三糖铁琼脂试验2、靛基质试验（吲哚试验）3、尿素酶试验4、氰化钾试验（KCN）5、赖氨酸脱羧酶试验,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,1、三糖铁（TSI）试验,肠道杆菌科为革兰氏阴性菌，可发酵葡萄糖产酸。三糖铁琼脂试验是利用糖类发酵之不同与硫化氢产生与否，将肠道杆菌科各组细菌或各菌属加以区分。三糖铁琼脂斜面培养基含有1乳糖及蔗糖与0.1葡萄糖作为发酵基质，且以酚红作为酸碱指示剂，如培养基由橘红转为黄色，表示有糖类发酵。测试时使用接种针先穿刺至底部，而后于斜面作划线接种，经培养18-24小时后，依情况判断糖类之发酵情形。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,制好的培养基,对照管,斜面红色，底面黄色,培养基全黄色,斜面、底部黄色，并产生H2S,斜面红色，底部黄色，产生H2S,底面黄色，并产生CO2,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,（1）斜面碱性（红色-）底部酸性（黄色+）产气或不产气（产气时会造成琼脂裂开）：表示仅葡萄糖发酵。因微生物优先分解葡萄糖产酸，使培养基变黄，但因葡萄糖含量低，于斜面产生之微量酸立即氧化而呈碱性反应，同时培养基中的蛋白质也随之利用而产碱，培养基底部则因氧张力较小，且微生物生长较慢，故仍维持酸性反应。（2）斜面酸性（黄色+）底部酸性（黄色+）产气或不产气：表示除了葡萄糖发酵外，乳糖与（或）蔗糖也发酵。由于乳糖与蔗糖浓度高，经继续发酵，可维持培养基斜面与底部保持酸性反应。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,（3）斜面碱性（红色-）底部碱性（红色-）或无变化（橘红色）：表示无糖类发酵。而蛋白质则于有氧或厌氧条件下进行代谢产生氨，而使培养基呈碱性反应，如有氧与厌氧均发生蛋白质分解，则斜面与底部均呈碱性反应。为使结果准确，应于接种培养18-24小时内观察结果，以确保糖类尚未用尽，且蛋白质分解之碱性终产物尚未产生。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,培养基变黑,（4）三糖铁琼脂培养基中亦含有硫代硫酸钠作为产生硫化氢之基质，且含硫酸亚铁作为检测此无色产物之指示剂，经接种培养后，若微生物有硫化氢产生，会与亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁之沉淀，进而使培养基变黑。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,2、靛基质（吲哚）试验阴性（液面黄）阳性（液面玫瑰红）,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,3、尿素酶试验阴性（黄）阳性（红）,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,5、赖氨酸脱羧酶试验 对照 阳性（紫）阴性（黄）,4、氰化钾试验“浑浊”为“+”,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,ONPG试验阳性（黄）空白,丙二酸盐试验阳性（兰）阴性（不变）,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,第一天 器材准备、样品处理和增菌培养,规格名称 数量 1、500mL三角瓶 2个 2、15150mm试管 20支 3、1mL移液管 5支 4、10mL移液管 2 支 5、直径为90mm平皿 12套 6、250mL量筒 1支 其它：均质器、玻璃珠等。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,第二天 接种选择性平板进行分离培养,从平板上挑取可疑菌落接种到：三糖铁琼脂、蛋白陈水、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)和赖氨酸脱羧酶试验培养基。,第四天 观察五项生化试验结果，判断沙门氏菌属性。,第三天 观察分离结果,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二节 沙门氏杆菌的检验与分析,第三节 志贺氏菌检验,（一）形态与染色 革兰氏阴性短杆菌、无荚膜，无芽胞，无鞭毛，有菌毛。23um0.50.7um,一、志贺氏菌生物学特性,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,（二）培养特性,1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37，PH7.27.42、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小的菌落3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,（三）生化反应,1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏菌外，均不发酵乳糖。2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。3、不产生H2S，不分解尿素，V-P试验阴性，不能利用柠檬酸盐。4、甲基红阳性。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,二、志贺氏菌的致病性与食物中毒,（一）传染源 食物、病人、粪便、苍蝇等,（二）志贺氏菌的致病性,致病因素：侵袭力、菌体内毒素、外毒素。临床症状：A、急性细菌性痢疾：急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢。B、慢性细菌性痢疾：慢性迁延型、慢性隐伏型、慢性急性发作型。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,GB/T4789.5-2003中志贺氏菌检验程序,三、志贺氏菌的检验,（一）实验内容,样品处理选择性增菌选择性平板分离生化学试验结果报告,第一天 样品处理和增菌培养,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二天 接种选择性平板进行分离培养（一）接种选择性平板 取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和EMB（伊红美蓝）琼脂平板各1个。（二）培养 放于36培养1824h。结果：志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发 酵乳糖的菌落。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,H E平板原理及反应,发酵乳糖的肠杆菌,不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌,不发酵乳糖，菌落呈蓝绿色或蓝色可能就是志贺氏菌,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,SS平板原理及反应SS Agar(Salmonella Shigella Agar),大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌。,是沙门氏菌。有黑色中心。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,麦康凯琼脂平板,菌落为粉红色，半透明的，可能为志贺氏菌。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,EMB平板照片及原理,菌落为无色半透明状，可能为志贺氏菌。,大肠杆菌,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第三天 初步生化试验（一）接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基 从HE或SS、麦康凯或EMB琼脂平板、挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏。经36培养1824h，分别观察结果。（二）培养 放于36培养1824h。结果：乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,志贺氏菌在TSI生长的结果（现象）：（1）斜面产碱仍为红色或粉红色；（2）底层产酸不产气，变黄色；（3）不产H2S，不出现黑色。志贺氏菌在葡萄糖半固体培养基生长：沿线生长，无动力。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,三糖铁（TSI）琼脂试验的原理,2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌,葡萄糖半固体原理及结果,1.铜绿假单胞菌2.志贺氏菌 3.枯草芽孢杆菌,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,在志贺氏菌检验中可弃去的培养物：,（1）在TSI表面上呈现蔓延生长的培养物（2）在1824h发酵乳糖、蔗糖的培养物（3）不分解葡萄糖，只在半固体培养基表面生长的培养物。（4）产气的培养物（5）有动力的培养物（6）产H2S的培养物,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第四天 进一步的生化试验,凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做进一步的生化试验和生化分型实验。,（一）进一步生化试验,即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，pH7.2尿素，KCN生长，以及水杨苷和七叶苷的分解，36培养。志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,（二）生化分群试验,接种生化培养基 从三糖铁琼脂上挑取培养物上,拌种到：5%乳糖、靛基质培养基中，36培养。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,各项生化试验现象,葡萄糖铵：阳性者斜面上有正常大小的菌落生长，阴性者不生长或生长极微小的菌落。西蒙氏柠檬酸盐：阳性者斜面上菌落生长，培养基由绿色转为蓝色，阴性者不生长。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶：阳性者为紫色，阴性者为黄色。pH7.2尿素：阳性者为红色，阴性者为黄色。KCN：阳性者细菌生长，阴性者细菌不生长。水杨苷和七叶苷：阳性者产气。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,（三）结果报告 综合生化试验结果判定菌型并作出报告。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第四节 金黄色葡萄球菌的检验,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,一、金黄色葡萄球菌生物学特性,革兰氏阳性球菌，直径为微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,大多数菌株最适生长温度30-37，最适pH为；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,所有的毒株产生血浆凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,生物学特性 致 病 性,金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。d.脱氧核糖核酸酶（DNA酶）e.肠毒素：引起急性胃肠炎。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,葡萄球菌皮肤感染,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,二、检验程序与操作方法,根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准：食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB 4789.10-2003 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,检样25g(ml)+225ml灭菌生理盐水,国标：金黄色葡萄球菌检验程序,直接计数方法,增菌培养方法,Baird-parker（贝尔德-帕克）0.3ml、0.3ml、0.4ml,75氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤,血平板,血平板，Baird-parker,涂片染色,观察溶血,血浆凝固酶试验,报 告,36 1 24hr,36 1 24hr,36 1 24hr,检验程序 增菌培养,利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤或7.5%氯化钠肉汤增菌。置37摄氏度培养箱培养24小时。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,检验程序 分离培养,血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,血平板制作,成分：豆粉琼脂（或营养琼脂）100mL，脱纤维羊血（或兔血）5-10mL。制法：加热融化琼脂，冷至50，以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装灭菌试管，摆成斜面。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,BP（贝尔德-帕克）平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和矿物元素丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,检验程序分离培养,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,在BP平板上典型菌落为：灰色到黑玉色，圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，边缘常为淡色（米黄色或灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,B-P平板,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,革兰氏阳性，球形，组成葡萄状,检验程序 鉴定之革兰氏染色镜检,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,检验程序 鉴定之凝固酶试验,金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶，因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。方法一：试管法 吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放361恒温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,试管法,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,阳性反应,阴性反应,不凝固,少量、零散凝固,明显的块状凝固,巨大块凝固,完全凝固，倒置不流动,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,有凝块,血浆,均匀混浊,生理盐水,方法二：玻片法 在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经1020s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,兔血浆制备成分：柠檬酸钠0.106 mol/L（31.3g Na3C6H5O72H2O溶于1L蒸馏水中）制法：一份加兔血9份混合后离心2000rpm，10min吸取上清液即为兔血浆。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,葡萄糖肉浸液肉汤的制备,成分：绞碎牛肉500g，氯化钠5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH7.47.6。制法：将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g，与蒸馏水混合后放冰箱24h，除去液面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨、葡萄糖，氯化钠和磷酸盐，溶解后校正pH，煮沸并过滤、分装，12130min高压灭菌。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,25g样品+225ml 生理盐水,5mL样品匀液（1:10）+50mL胰酪胨大豆肉汤,血平板,36 1 24hr,镜 检 与肉浸液肉汤培养,血浆凝固酶试验,报告结果,定性检测,36 1 24hr,36 1 24hr,36 1 6hr,BP平板,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,25g样品+225ml 生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）,平板计数（分别记录每种类型的菌落数）,36 1 48hr,血平板、镜 检与 肉浸液肉汤培养,血浆凝固酶试验,报告结果 金葡菌数/g(mL),定量检测（平板法）,每种类型选取一个菌落,36 1 24hr,36 1 6hr,适用于检测金黄色葡萄球菌数不小于10/g（mL）的食品计算办法：（三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加）血浆凝固酶阳性数5 稀释倍数,梯度稀释,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第一天 器材准备、样品处理、增菌培养和BP平板分离接种,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第二天 接种选择性平板进行分离培养和玻片法血浆凝固酶试验,1、血平板制备及兔血浆制备2、接种选择性平板取增菌液1环，划线接种于血平板或BP平板。3、培养 放于361培养24h。4、玻片法血浆凝固酶试验,第三天 观察分离结果、镜检和葡萄糖肉浸液肉汤制备及接种,第四天 血浆凝固酶试验（试管法）、实验报告,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,第五节 单核增生李斯特菌检验,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,李斯特氏菌属,李斯特氏菌属（Listeria）普遍存在于环境中，最新的分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii）无害李斯特氏菌（Listeria innocua）斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。,生物学特性-菌体形态及染色特征,革兰氏阳性；小的、类似球形杆菌，0.40.50.52m，在有些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成V形，或成群的细胞沿长轴方向平行排列，在较老的或生长不良的培养物中，可能形成丝状；20-25以4根周生鞭毛运动，在37只有较少的鞭毛或1根鞭毛；无芽孢、无荚膜。,第五章 食品中微生物标准检验与分析技术,生物学特性-培养特性,兼性厌氧；在20-25培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。生长温度范围为2-42（也有报道在0能缓慢生长），最适培养温度为35-37。pH范围。,生物学特性-培养特性,在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上，用45角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。,生物学特性-生化反应,触酶阳性，氧化酶阴性。能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。,生物学特性-血清型,根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。,生物学特性-抵抗力,该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活；对碱和盐抵抗力强，60-70经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌；湿热灭菌（121，至少15min）和干热灭菌（160-170，至少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和射线敏感；该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素（已产生抗性）、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。,流行病学,分布：广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播寄主范围：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫,流行病学,据报道，有1-10%的人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制作的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。约有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。,1996年至1999年，因单核增生李斯特氏菌回收的食品种类（来源：USDA及FDA报告）,致病性及其治疗,该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产或死婴、脑膜炎、败血症直至死亡。由该菌造成的脑膜炎的致死率可高达70%，败血症的死亡率达50%，围产期或新生儿感染的死亡率超过80%，怀孕期妇女的感染，母亲通常能存活下来。抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，或与氨基糖苷类抗生素一起用药。,感染人群,感染剂量未知，但与该菌的毒力和易感人群的年龄、免疫状态有关。易感者：孕妇/胎儿围产期和新生儿的感染；接受皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植 治疗、艾滋病患者等免疫缺损者；癌症病人 尤其是白血病的患者；不太常见的报道糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡性结肠炎的患者；年纪较大的人；没有免疫缺陷的健康的人，食用污染该菌尤其是大量污染该菌的食品后，也有患病的危险。,致病机理,单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；3、溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培养物上清液中获得，有和两种，为毒力因子。,实验室危害,不是一种普遍的与实验室相关的传染病，目前只有少数有报道的案例发生；直接摄取是最普遍