革兰阳性菌分类生物学特性及鉴定.ppt

革兰阳性菌分类生物学特性及鉴定,内 容,革兰阳性球菌革兰阳性杆菌API鉴定系统,细菌分类工具书,伯杰氏细菌系统分类学手册（Bergrys Manual of Systematic Bacteriology）细菌分类的标准Springer-Verlag 公司 2001 年春出版手册，第二版五卷本是最新版本,革兰阳性球菌新分类,BXIII门,1目,2目,第5科,第III纲,葡萄球菌科,乳杆菌科,第2科 气球菌科,其他目,第1科,第4科,肠球菌科,第5科,明串珠菌科,第6科,链球菌科,葡萄球菌科,葡萄球菌属（Staphylococcus）,孪生球菌属(Gemella),其他属,乳杆菌科,片球菌属（平面球菌）(Pediococcus),其他属,气球菌科,气球菌属(Aerococcus),乏养菌属(Abiotrophia),狡诈球菌属(Dolosicoccus),其他属,费克蓝姆氏菌属(Facklamia),球链菌属(Globicatella),肠球菌科,肠球菌属(Enterococcus),漫游球菌属(Vagococcus),其他属,四联球菌属(Tetragenococcus),明串珠菌科,明串珠菌属(无色藻菌属)(Leuconostoc),其他属,链球菌科,链球菌属(Streptococcus),乳球菌属(Lactococcus),BXIV门,I纲,II亚目,第I科,微球菌属(Micrococcus),口腔球菌属(Stomatococcus),其他属,微球菌科,革兰阳性球菌生物学特性,G+球菌,触酶,+,-,微球菌属,链球菌属,葡萄球菌属,口腔球菌属,肠球菌属,孪生球菌属,片球菌属,明串珠菌属,气球菌属,其他属,葡萄球菌属微球菌属口腔球菌属,常见触酶阳性菌属,触酶阳性常见菌属鉴别,葡萄球菌 微球菌,呋喃唑酮,杆菌肽,呋喃唑酮,葡萄球菌属,分类,35个种、17个亚种分为凝固酶阳性和阴性的葡萄球菌,主要鉴定试验,触酶 血浆凝固酶 新生霉素敏感试验 DNA酶,触酶试验（Catalase）：原理：2H2O2 O2+2H2O,Catalase NEG,注意事项：1、细菌、试剂新鲜 2、血琼脂上菌落不宜作此试验 3、阴、阳性对照,凝固酶试验（Coagulase）,玻片法：结合凝固酶（凝集因子）纤维蛋白原纤维蛋白,试管法：游离凝固酶 凝血酶原凝血酶类物质,Coagulase NEG,阳性 胶胨状,阴性 液体状,DNA酶 原理：DNA酶水解DNA长链，形成数个单核苷酸组成的单核苷酸链。长链DNA被酸沉淀、单核苷酸溶于酸 而出现透明环。,操作：将待测菌点种于DNA琼脂平板上，35培养24-48h，在细菌生长物上加试剂（菌落浸没）试剂：1mol/L 盐酸注意事项：培养基表面凝固水烤干避免细菌蔓延状生长,葡萄球菌生物学特性,菌落特点：血平板上 中等大小，光滑，凸起,边缘整齐、金黄色、黄色或白色，溶血或不溶血的菌落 麦康凯上 红色菌落 CLED上 黄色菌落 中国兰上 不生长,金黄色葡萄球菌,菌落特点：光滑、完整微隆起、半透明，-溶血，奶黄色、橙黄色、柠檬色、白色，（脂溶性色素）,表皮葡萄球菌,菌落特点：菌落相对较小，2.56.0mm，取决于不同菌株，通常不产生色素，某些菌株产生黏液性常黏附在琼脂表面,腐生葡萄球菌,菌落特点：菌落58mm大小，完整，有光泽，不透明、光滑，比前面提到菌种菌落较凸起，约一半菌株产色素，奶油、黄-橙色。,腐生葡萄球菌,头葡萄球菌,孔氏葡萄,木糖葡萄,镜下特点：G+C、葡萄状排列,葡萄球菌生物学特性,凝固酶阳性葡萄球菌鉴别试验,凝固酶阴性葡萄球菌鉴别试验,鉴定流程,菌落观察：金黄色、黄色或白色，溶血或不溶血,涂片染色：G+球菌、单个、成双，葡萄状排列,触酶试验+,+凝固酶试验-,金葡菌中间葡萄猪葡萄施氏葡萄海豚葡萄水獭葡萄,葡萄糖O/F,CNS,微球菌属,+,-,微球菌属,分类,微球菌属共9个菌种代表菌为藤黄微球菌,微球菌属生物学特性,菌落特点：血平板上小、圆形、凸起、光滑不透明菌落，可产生黄色、粉红色菌落。镜下：GC+、多为四联、八叠状排列,藤黄微球菌,菌落：BA上菌落小于葡萄球菌，呈圆形、突起、光滑、不透明黄色菌落镜下：G+球菌体比葡萄球菌大，单个成双，四联八叠排列、包裹状不规则固块生化反应：触酶+氧化酶+，胆汁七叶苷 精氨酸双水解酶 枸橼酸盐 硝酸盐均阴性,血琼脂：Micrococcus luteus,营养琼脂：Micrococcus luteus,革兰染色：Micrococcus luteus,粘液口腔球菌,粘液口腔球菌生物学特性,菌落特点：多为粘液状，无色至白色，牢固粘附于琼脂表面 镜下：G+大球菌，成双或成对排列生化反应：触酶大多阴性，少数弱阳性，氧化酶为阴性、可在含5%NaCl的营养琼脂上生长可形成荚膜,革兰染色：stomatococcus mucilaginosus,触酶阴性革兰阳性球菌,链球菌属,肠球菌属,孪生球菌属,片球菌属,明串珠菌属,气球菌属,链球菌属,Lancefield血清学分群：A、B、C、D、F、G等18个群溶血：、,分类,生物学特性,菌落特点：灰暗色、扁平、干燥，溶血 或不溶血镜下形态：G+球菌，单个、成双或短 链排列,链球菌属主要鉴定试验,溶血 杆菌肽试验 CAMP试验 Optochin试验 PYR试验 血清凝集,杆菌肽（Bacitracin）试验操作：K-B法贴杆菌肽纸片（直径6mm，0.04U/片），常规培养18-24h结果判读：抑菌圈10mm 敏感。,CAMP试验：原理：细菌具有“CAMP”因子，能促进葡萄球菌溶血素的活性，使两种细菌在划线处呈现箭头形透明溶血区。,操作：血平板上待测菌与金葡菌垂直划线，划线之间留出 0.5-1cm,不能相接。,无乳链球菌,金葡菌,Optochin敏感试验,原理：Optochin（乙基氢化去甲奎宁的商品名）可干扰肺炎链球菌叶酸的生物合成，抑制该菌的生长 故肺炎链球菌对其敏感，而其他链球菌 对其耐药。结果判定 抑菌圈 14mm为肺炎链球菌,注意事项 1、做敏感试验的平板不能在CO2环境下培养，因其可使抑菌圈缩小。2、同一血琼脂平板可同时测定几株菌株，但不要超过4株菌。3、纸片可保存于冰箱中，一般可保存9个月。但如果已知敏感的肺炎链球菌检测为耐药时，纸片应废弃。,PYR试验原理 细菌产生吡咯烷酮酰肽酶（PEP）、水解L-吡咯烷酮-萘酚酰胺（PYR）基质，释放-萘酚酰胺与试剂N，N-二甲氨基肉桂醛反应，产生桃红色为阳性。,操作：将被检菌株接种上述试验平板上，35过夜培养后，加入一滴PYR试剂于菌落上，1min后观察结果。结果判断 菌落出现桃红色为阳性，即水解PYR阳性，若菌落呈黄褐色是阴性。,PYR商品化产品,血清分群诊断：A、B、C、D、F、G,A群链球菌(化脓链球菌),主要鉴定要点 溶血 杆菌肽敏感 PYR试验阳性,阴性,阳性,PYR试验,溶血,杆菌肽敏感,临床标本培养后 混杂在口腔正常菌群中的化脓链,B群链球菌（无乳链球菌）,主要鉴定要点 溶血 CAMP试验阳性 马尿酸钠试验阳性,CAMP试验阳性,溶血,C群链球菌（似马链球菌 兽疫链球菌 马链球菌等）,马尿酸钠 阴性6.5%氯化钠 阴性血清学分型 C群杆菌肽 耐药,主要鉴定要点,马链球菌溶血,D群链球菌（非肠球菌，牛链球菌等）,主要鉴定要点 胆汁七叶苷阳性 6.5%氯化钠阴性,牛链球菌 溶血,C、F、G群链球菌的鉴定：常需要血清学方法,肺炎链球菌,生物学特性,菌落特点：血平板上菌落细小、溶血、圆形、表面光滑、灰白色、边缘整齐，开始扁平、以后中心塌陷，呈脐窝状。镜下形态：菌体矛头状成双排列生化反应：Optochin敏感，胆汁溶菌试 验阳性。,肺炎链球菌,脐窝状菌落,粘液状菌落,肺炎链球菌,Optochin敏感,胆汁溶菌试验阳性,2号清亮阳性,1号 浑浊 阴性,肺炎链球菌乳胶凝集试验,阳性,阴性,对照,阳性,肺炎链球菌干点凝集试验streptococcus pneumoniae oxoid dryspot,草绿色链球菌,草绿色链球菌的鉴定,鉴定流程,触酶试验-G+球菌,溶血,溶血,溶血,+Optochin试验-+胆汁溶菌试验-,肺链,牛链球菌及其他,+CAMP试验-,杆菌肽敏感PYR试验阳性血清学分型,其他链球菌,无乳链,化脓链,肠球菌属,分类,正式命名的菌种有16个，分属在5个群。,生物学特性,菌落特点：血平板上呈灰白、隆起、细小，溶血或溶血。镜下形态：G+球菌,单个、成双、短链。,生化反应 胆汁七叶苷试验（+）6.5NaCl生长试验（+）PYR试验（+）血清学分类属D群,粪肠球菌,肠球菌属分群,肠球菌属群菌种的关键性试验,肠球菌属群菌种的关键性试验a,甲基葡萄糖吡喃糖苷(Methyl廿D-Glucopyranoside MGP)产酸试验1、配制含有10 gL MGP和0006溴甲酚紫的牛心浸液，分装试管每管2 ml，121灭菌10 min。2、接种细菌(血平板上取数个菌落或过夜肉汤1滴)，孵育351天，必要时可孵7 天3、肉汤由紫变黄色表示阳性。,几个关键性试验,Rapid MGP Medium(5 h),Enterococcus gallinarum(ATCC 49573)MGP+,Enterococcus faecalis(ATCC 29212)MGP-,sensitivity 100%specificity 96.5%,依罗霉素(Efrotomycin EFRO)敏感试验 1、溶解100 mgEFRO于0.1 ml二甲亚砜中，再 加蒸馏水9.9 ml，取10l至每1片滤纸片，置室温 暗处56 h。2、大量接种细菌于胰酶大豆胨平板，放EFRO 纸片，孵育35 1824 h。3、出现任何抑菌环表示EFRO敏感。,肠球菌属群菌种的关键性试验,肠球菌属群菌种的关键性试验,肠球菌属群菌种与漫游球菌的鉴别,触酶阴性其它属的生物学特性,革兰阳性球菌临床分布:Mohnarin2006-2007 占31.3%;Mohnarin2008 占31.68%;Mohnarin2009 占30.59%;,葡萄球菌 64%,肠球菌24%,链球菌 10%,其他2%,2008年G+菌分布,2009年G+菌分布,葡萄球菌 63.8%,肠球菌22.8%,链球菌 10%,其他3.4%,革兰阳性杆菌,常见菌属,棒杆菌属(Corynebacterium)李斯特氏菌属(Listeria)丹毒丝菌属(Erysipelothrix)分支杆菌属(Mycobacterium)奴卡氏菌属(Nocardia)红球菌属(Rhodococcus),产单核李斯特菌,生物学特性,菌落特点：BA上小、圆形、灰白色，产生狭窄溶血环，营养琼脂上圆形、光滑、透明镜下形态：G+短小杆菌，多成双排列生化反应：触酶+4生长 CAMP+,L.monocytogenes狭窄溶血环,L.Monocytogenes,猪红斑丹毒丝菌,生物学特性,菌落特点：BA上形成两种菌落，光滑型菌落细小、圆形、凸起有光泽；粗糙型菌落大，表面颗粒状、边缘卷发状；延长培养时间可见溶血镜下形态：G+短小杆菌，单个、短链，或长丝状生化反应：触酶阴性 氧化酶阴性 液化明胶 H2S+,Erysipelothrix rhusiopathiae,Erysipelothrix rhusiopathiae(Gram,culture),快速生长分支杆菌（非结核分支杆菌）,生物学特性,最常见菌种有：偶发分支杆菌、脓肿分支杆菌、龟分支杆菌菌落特点：快速生长的分枝杆菌区别于结核分枝杆菌，它们在血平板和麦康凯平板上3-7天便可生长，单个菌落、菌落分为粗糙型和光滑型镜下形态：G+杆菌、直或微弯曲生化反应：抗酸染色 阳性,星型奴卡氏菌,生物学特性,菌落特点：BA上菌落粗糙、干燥，黄色或深黄色，有时带有“泥土”味道 镜下形态：G+丝状生化反应：抗酸染色 阳性（1%硫酸脱色）,37 5%CO2条件下，星型奴卡菌在沙保弱或普通培养基，2-6天内生长成肉眼可见的黄色或橘黄色菌落,革兰阳性菌，具有弱抗酸性（1%硫酸脱色）是它的特点,马红球菌,生物学特性,菌落特点：BA上1-2mm菌落，继续培养可见大、粘液样淡橘红色到粉红色菌落镜下形态：G+杆菌，多型性生化反应：触酶+，氧化酶-，不分解任何糖类，CAMP+,马红球菌粘液样菌落,CAMP试验：（中间为金葡菌，两侧为马红球菌，羊血平皿。）,Rhodococcus equi(culture,Gram),需氧革兰阳性芽孢杆菌,炭疽芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌地衣芽孢杆菌,炭疽芽孢杆菌,是最大的革兰氏阳性杆菌 两端截平在动物或人体标本中单个或短链状排列 有明显荚膜培养后呈长链如竹节状无鞭毛在有氧和温度适宜（25 30）环境下易形成椭圆形芽孢位于菌体中央折光性强,生物学特性,需氧或兼性厌氧菌生长要求不高 最适温度为30 35普通琼脂培养基上形成灰色 扁平 干燥 粗糙型菌落边缘呈卷发状血平板上不溶血或弱溶血液体培养基中生长卷绕成团呈絮状沉淀物 液体澄清无菌膜,炭疽芽孢杆菌镜下形态,Bacillus anthracis,产毒株在含有0.7%碳酸氢钠营养琼脂上 5%7%CO2环境孵育过夜可产生荚膜 形成黏液型菌落无毒株为粗造型,能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、蕈糖有些菌株能迟缓发酵甘油和水杨素产酸不产气能分解淀粉不发酵鼠李糖、半乳糖等能还原硝酸盐为亚硝酸盐明胶液化,V-P试验不定不产生吲哚和硫化氢不利用枸橼酸盐不分解尿素卵磷脂酶阳性触酶阳性,发酵糖类产酸不产气 w 迟缓,炭疽芽孢杆菌生化反应,炭疽杆菌的抗原分为两类细菌性抗原 包括菌体多糖抗原、荚膜多肽抗原 和芽胞抗原炭疽毒素 外毒素复合物,人的主要传染源为病畜和死畜主要传播途径为摄入污染食物或皮肤接触引起肺 皮肤 肠炭疽病均可并发败血症和炭疽性脑膜炎被列为 生物恐怖武器潜在性病原菌,临床意义,炭疽芽孢杆菌是人畜共患急性传染病 炭疽病的病原菌,皮肤炭疽,蜡样芽孢杆菌,革兰氏阳性大杆菌生长6小时后形成圆形芽胞位于菌体中心或次末端 不突出菌体菌体两端不平整多成链状排列引起食物中毒的菌株多为周毛菌有动力 不形成荚膜,生物学特性,需氧或兼性厌氧营养要求不高普通营养琼脂生长良好最适温度为35菌落较大 灰白色 不透明常沿划线蔓延扩展成片如同白蜡血琼脂平板菌落浅灰色 毛玻璃样伴草绿色溶血或呈-溶血,蜡样芽孢杆菌镜下形态,-溶血,显色平板,卵黄培养基上培养3h后尚未见细菌集落但能看到卵磷脂分解形成白色浑浊环 烛光反应液体培养基中生长均匀混浊 有菌膜,能分解葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 水杨素 果糖等液化明胶V-P试验阳性卵磷脂酶阳性食物中毒菌株的游离芽胞能耐受10030min干热120经60min才能杀死,蜡样芽孢杆菌生化反应,引起食物中毒有两型腹泻型 由不耐热的肠毒素引起呕吐型 由耐热的肠毒素引起,蜡样芽孢杆菌杆菌广泛分布在土壤、水、尘埃、淀粉制品乳及乳制品等食品并在其中繁殖引起食物中毒 可致败血症,临床意义,地衣芽孢杆菌,大多数菌株精氨酸双水解酶阳性可诱导产生青霉素酶产生多肽抗菌素,整肠生,源 首,地衣芽孢杆菌,蜡样芽孢杆菌,API鉴定系统,API是 Analytic Products INC的简称。API鉴定系统是由法国生物-梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统。是世界范围内应用最广、种类最多、最受微生物学人员欢迎的产品之一。,品种齐全,包括的范围广,鉴定的能力强,数据库在不断地完善和补充 目前约有 10 0 0种生化反应,可鉴定的细菌 大于 5 5 0种。,常用API鉴定条,API 20E 肠杆菌科革兰阴性菌API 20NE 非肠杆菌科革兰阴性菌API 20C AUX 酵母菌 API STAPH 葡萄球菌属和微球菌属API STREP 链球菌属API CORYNE 棒状杆菌属API NH 奈瑟菌、嗜血杆菌属API,API原理,API 条板孔内含微量生化试剂，加入待检菌液后，35孵育424小时，基质顔色即可发生改变，依据判读标准表判读结果，并将结果转化为数码3个反应为一组，第一位阳性为1，第二位阳性为2，第三位阳性为4，阴性均为0，查询API菌码手册得出鉴定结果。,API STAPH 结果判读表,API 20 STREP 结果判读表,小 结,细菌鉴定时，应尽量鉴定到菌种新的细菌不断出现，及时更新细菌分类知识,谢谢！,