重组技的基本工具.ppt
专题1 基因工程,科技探索之路 基础理论和技术的发展催生了基因工程,一、在基础理论上取得重大突破 1.DNA是遗传物质的证明 2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立 3.遗传密码的破译二、技术发明使基因工程的实施成为可能 1.基因转移载体的发现 2.工具酶的发现 3.DNA合成和测序技术的发明 4.DNA体外重组的实现 5.重组DNA表达实验的成功 6.第一例转基因动物的问世 7.PCR技术的发明,1.1 DNA重组技的基本工具,该技术就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。又叫基因拼接技术或DNA重组技术。,（一）基因工程的概念,目的性强，定向改变生物，培育新品种；能克服生物远源杂交不亲合障碍。,优点：,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接导入,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),1:提取抗虫基因需要:基因的剪刀限制性核酸内切酶,2:抗虫基因与运载体DNA连接需要:基因的针线DNA连接酶,3:抗虫基因导入受体(棉花)细胞需要:基因的运载工具运载体,1.限制性核酸内切酶“分子手术刀”,限制性核酸内切酶(简称限制酶)是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。特点：特异性。即一种限制性核酸内切酶(简称限制酶)，只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,（二）DNA重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶切割点,限制酶,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,黏性末端：指被限制酶切开的DNA两条单链的切口上所带有几个伸出的核苷酸。,游离片段,要想获得某个特定的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以合成重组的DNA分子。,2.DNA连接酶“分子缝合针”,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来。即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样就形成了一个重组的DNA分子。,外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？,导入过程需要运输工具运载体。,运载体的作用有哪些？,作用1：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用2：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。,作为运载体必须具备哪些条件？,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便于目的基因插入载体中3）具有某些标记基因，便于进行筛选，如对抗菌素的抗性基因载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去5)载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作,3.基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,常用的运载体主要有两类：1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体的衍生物和动植物病毒,质粒是能够自我复制的小型环状DNA分子。现在专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。是基因工程最常用的运载体，常需人工改造。,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，常含有抗药性基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。,双基练习：,1.限制性核酸内切酶“分子手术刀”(1)主要来源:从_生物中分离出来的(2)特点:能够识别DNA特定的核苷酸序列，切开两个_之间的_。(3)DNA末端:限制酶切割DNA产生的DNA末端有两种形式:_和_。2.DNA连接酶“分子缝合针”(1)作用:将双链DNA片段，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_。(2)种类:E.coli DNA连接酶:只能缝合DNA的。T4 DNA连接酶:既可缝合DNA的_，又可缝合双链DNA的_。,“缝合”起来,原核,核苷酸,磷酸二酯键,黏性末端 平末端,磷酸二酯键,黏性末端,黏性末端,平末端,3.基因进入受体细胞的载体“分子运输车”(1)载体的种类 质粒:是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有 能力的双链_ DNA 分子；_ 的衍生物；_。(2)载体的特点 能够在受体细胞内_。有一个或多个 切割位点，供外源DNA的插入。具有，供重组DNA的鉴定和选择。,标记基因,自我复制,环状,噬菌体,动植物病毒,自我复制,限制酶,4可用于基因工程载体的DNA分子()。A细菌DNA B病毒DNA C噬菌体DNA D质粒DNA5细菌质粒特征包括()。A能独立自我复制的线形DNA分子 B含有1050个基因的小型、结构简单的DNA分子C细菌存活所必需的成分 D能从一个细菌转移到另一个细菌,BCD,BD,6已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指。如果在该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）A3 B4 C9 D12,C,有这样一些可能：a b c d b+c+d a+b c+d a+b+c b+c,7、在DNA测序工作中，需要将某些限制性核酸内切酶的限制位点在DNA上定位，使其成为DNA分子中的物理参照点，这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶Hind、BamHI和二者的混合物分别降解一个4 kb(1 kb即1千个碱基对)大小的线性DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性核酸内切酶在该DNA分子上的限制位点数目是(),AHind 1个，BamHI 2个 BHind 2个，BamHI 3个CHind 2个，BamHI 1个 DHind 和BamHI各有2个,A,
