重组子导入和筛选精美生物医学.ppt
重组子导入、表达与筛选,找找看,重组DNA导入的目的是什么？请简单描述需要被纯化掉的对象转化率是什么？该怎么计算表达？影响转化率的因素是什么？,一、重组DNA分子导入宿主细胞,什么是转化（transformation）？将重组DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。什么是转染（transfection）?将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程。,基因重组,转染,体外包装,噬菌体,噬菌体体外包装,1原核细胞的转化（细菌转化）,1)受体细胞的选择,限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染,宿主细胞 原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞,重组体分子导入原核细胞 感受态细菌：细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收,（1）CaCl2转化：,细菌处于0度，二价阳离子存在的低渗溶液中，细菌膨胀成球形，处于感受态。此时加热在42度的热冲击下进入细胞，在培养基上生长数小时后球形细胞恢复原状并繁殖。转化效率为105106/ug,（2）电击法（electroporation）：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高1091010/ug,原理 利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。,3）转化率：DNA分子转化宿主细胞获得转化子的效率什么叫转化子？导入外源DNA分子后能稳定存在的宿主细胞什么叫重组子？导入的外源DNA为重组DNA的转化子,表达方式：A、转化子数/用于转化的DNA分子总数B、转化子数/宿主细胞总数计算示例，见书132页,影响因素：重组DNA：分子量小，转化率高；亲和性强的质粒载体转化率高；ccc质粒DNA载体转化率高受体细胞转化方法：电击法转化率最高；氯化钙法次之,（1）农杆菌转化法,2、导入植物细胞,基因枪法,基因枪法（gene gun）是依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。,（二）基因枪介法,优点：（1）无宿主限制。可以对任何基因型材料进行转化研究；(2)靶受体几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞。（3）易于操作。缺点：如转化频率低、结果的重复性差，易导致基因沉默，实验成本较高等。,（二）基因枪法,3、导入动物细胞,显微注射技术,含目的基因的表达载体,动物受精卵,含目的基因的受精卵,早期胚胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因动物,显微注射,分裂分化,移 植,发育,脂质体法,重组体,脂质体,受体细胞,含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过 规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）,找找看,基因表达系统有哪些？基因表达系统应该具有什么条件？重组子筛选的意义是什么？有哪些方法可以用来筛选重组子？,最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高;表达产物稳定;生物活性高;表达产物容易分离纯化。,第一节基因的表达系统与表达策略,宿主细胞的选择,一、适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。,二、宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。,大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。有各类菌株和载体系列。目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。易培养，成本低。,缺点：大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。,酵母 酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。,重组子的筛选和鉴定,（一）根据载体的性状变化进行筛选,1 根据载体的抗药性标记进行筛选,载体上的抗药基因：抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 抗卡那霉素基因等,凡是转入了载体的细胞都获得了这种抗药性，可以在平板上生长菌落。,当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。,2 根据载体抗药性插入失活选择,根据载体抗药性标志插入失活选择 含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。,外源基因,抗Amp,抗Tet,抗Amp,抗Amp,抗Tet,抗Tet,重组DNA,空载体,不含有载体或重组DNA,3-半乳糖苷酶系统,-半乳糖苷酶系统 载体：pUC、pGEM系列载体等 带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列，其中含有编码-半乳糖苷酶（-galatosidase）基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。,当这种载体转入的宿主细胞是含有-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列和C端序列可以互补（成为互补），产生具有酶活性的蛋白质（-半乳糖苷酶），从而使宿主细菌在含有IPTG,X-gal的培养基上呈蓝色。当多克隆位点有外源DNA片段插入时，破坏此酶的N端阅读框架，产生无互补功能的N端片段，因此在带有外源DNA片段的细菌在含有IPTG/X-gal的培养基上呈白色。,LacZ基因,-半乳糖苷酶,在X/gal培养基上呈现兰色,X-gal X(发色底物)+gal(半乳糖),-半乳糖苷酶,4 根据外源性DNA片段性状进行筛选 根据外源基因可能表达的蛋白质对缺 乏该蛋白的细菌的影响,如果外源性DNA片段可编码产生蛋白质，并且该蛋白质为细菌生命活动所必需，可利用该蛋白质的性状进行筛选。如亮氨酸是细菌生命活动所必需的，当外源性DNA片段含有合成亮氨酸的基因时，将该外源性DNA片段转入亮氨酸缺陷的细菌中，放入仅含亮氨酸的培养基中，只有能利用亮氨酸的细菌才能生长，因此，能生长的细菌即为含有外源性DNA片段。,（二）根据重组DNA的结构特征进行筛选 1、重组DNA的快速裂解、鉴定 初步筛选方法，根据重组DNA大小和载体DNA大小之间的差别来区分的。琼脂糖凝胶中进行电泳分离，紫外灯下观察并比较与载体DNA片段迁移率，初步判断是否有外源DNA插入。,2、限制性内切酶图谱进行分析 限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳分析是否有外源DNA的插入。,（三）分子水平,检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,提取受体生物全部DNA,适当限制酶切割,DNA片段,用同位素标记的目的基因片段杂交,显 出杂交带,（表明目的基因已插入）,分子杂交技术,核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组DNA的最通用方法，杂交方法 适用范围菌落印迹杂交 检测细菌体固定在膜上后，经裂解释放的DNA斑点杂交 检测未经凝胶电泳分离的，固定在膜上的DNA或RNA原位杂交 直接检测细胞或组织中的DNA或RNASouthern 印迹杂交 检测经酶切、凝胶电泳分离的，已转移到膜上的DNA Northern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离的，已转移到膜上的RNA,（二）个体水平,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,4 PCR反应进行鉴定 利用引物直接扩增外源基因进行检测,肺腺癌-cat mRNA 原位杂交法400,Smad2 mRNA在系膜增生型IgA肾病肾小球的表达 原位杂交200,
